[发明专利]一种激肽释放酶7在血液中的活性检测方法及其作为诊断胰腺癌的血清标志物上的应用

说明书

本发明提供一种激肽释放酶7在血液中的活性检测方法，具体为将所收集的待测血液样品于4℃冰箱静置12小时后离心取上清液并保存于‑80℃冰箱。检测前血清用1×PBS液按1：5进行稀释分装待检测实验；分配96孔酶联板，加入50μL待测血清样品，轻摇孵育2h；去除孔内的液体，加入wash buffer洗孔3次，每次加入washbuffer后放置摇床5min，将吸水纸平铺于桌面，轻拍酶联板使孔内液体去除干净；加入KLK7 FRET荧光底物McaRPKPVENvalWRK(Dnp)NH₂于每孔内，于37℃下置于摇床上轻摇孵育30min；于荧光酶标仪中在激发光波长320nm，发射光波长405nm下进行检测。

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是指激肽释放酶7(Kallikrein 7)在血液中的活性检测及其在胰腺癌临床诊断中的应用。

背景技术

胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤，病死率约占年发病率的83％。20世纪80年代，胰腺癌的5年生存率约3％，到21世纪初达到7％。由于起病隐匿，加之胰腺具有独特的解剖结构和生物学特性，60％的胰腺癌患者确诊时已存在远处转移，且对传统放化疗等治疗手段不敏感，故预后极差，中位生存期仅6至9个月。胰腺导管腺癌是胰腺癌中最常见的病理类型，囊腺癌、神经内分泌肿瘤、肉瘤、腺泡细胞癌和淋巴瘤等病理类型临床相对少见。手术切除仍是目前治疗胰腺癌的主要措施，但由于缺乏有效的早期诊断，只有约10％～20％的病人就诊时适宜手术切除，这部分病人仅占胰腺癌病人总数的极小部分。70％～80％的病人由于肿瘤无法切除，必须通过非手术治疗来改善生活质量并延长生存期。即使是肿瘤切除的病人，既往研究也表明扩大手术范围和广泛淋巴结清扫并不能进一步提高胰腺癌的存活率。因此重视胰腺癌的早期诊断，提高胰腺癌早期确诊率，增加胰腺癌患者手术切除机会是提高胰腺癌存活率的一个重要环节。

人组织激肽释放酶7(kallikrein-related peptidase 7，KLK7)亦称角质层胰凝乳蛋白酶(stratum corneumchymotryptic enzyme，SCCE)，最初是从皮肤中提取鉴定的一种分泌型蛋白质。KLK7基因是激肽释放酶家族15个成员之一，与其他激肽释放酶基因在碱基序列水平有高度同源性，其编码的蛋白与同家族其他成员在氨基酸水平同源性亦较高，蛋白质三级结构和功能有很多相似性。在人体很多体液中均可检测到较高水平的KLK7蛋白，如：羊水、卵巢癌患者腹水、脑脊液、乳汁、唾液、精液、血清、关节滑膜液、尿液、汗液等。在皮肤中，KLK7通过水解细胞间介导凝聚的交界结构胞外粘合蛋白包括桥粒芯蛋白、桥粒糖蛋白等，导致皮肤的脱屑。国内外大量研究表明KLK7与肿瘤的侵袭与转移息息相关，其可能的机制是其水解细胞外基质，促进细胞脱离，肿瘤细胞借此更易侵袭与转移。VladimirIakovlev等应用组织芯片免疫组化法检测包含胰腺癌不同发展过程(胰腺正常组织、胰腺上皮内瘤变与侵袭性胰腺导管腺癌)的全组织切片中KLK7表达水平，以评估KLK7对胰腺癌预后意义，研究发现在胰腺上皮内瘤变进展中后期开始出现KLK7表达异常，胰腺导管腺癌中KLK7表达增高与预后不佳相关。另外，有体外实验研究显示：KLK7水解上皮型钙粘蛋白，产生的可溶性上皮型钙粘蛋白片段，可显著增强PANC-1细胞侵袭细胞外基质蛋白的能力，而胰腺癌PANC-1细胞聚集相应减少。提示KLK7可能在胰腺癌的侵袭和转移过程中起重要作用，胰腺癌细胞表面存在KLK7可造成肿瘤细胞脱落，导致肿瘤早期发生转移。

到目前为止，还没有一种有效的血清标志物用于胰腺癌临床诊治中。通过免疫组化实验，我们发现在胰腺癌组织中KLK7的蛋白表达量相对于癌旁组织大幅上调，且胰腺组织附近血管丰富，因此我们猜测在血清中胰腺癌患者的KLK7含量相对于正常人来说也会升高。因此，如果KLK7能作为胰腺癌辅助诊断的血清标志物，对胰腺癌患者的早期诊断及治疗方案的选择将具有极大的临床应用价值。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种胰腺癌血清标志物的检测方法，并将该检测方法与影像学技术及其它生物学标志物联合应用，用于胰腺癌患者的临床早期辅助诊断中。