[发明专利]一种定量检测血清中葡萄糖的方法

说明书

本发明公开了一种快速、灵敏的血清中葡萄糖的定量检测方法。属于生物化学试剂检测领域。该方法先以有机溶剂去除血清中的蛋白质，经过结构中含有硼酸基团和季铵基团化学标记后，采用黑磷辅助激光解吸电离‑飞行时间质谱分析，进而实现血清中葡萄糖的定量检测。该方法操作简单快速，可在5分钟内完成整个实验流程；消耗的样品量少，仅在0.5微升血清中就可实现内源性葡萄糖的检测；结果准确，满足大规模测定样本的要求。

技术领域

本发明属于生物化学试剂检测领域，具体涉及一种准确、快速和灵敏的血清中葡萄糖的定量检测方法。

背景技术

葡萄糖(glucose)是一种己糖，人体内各组织细胞活动所需的能量大部分来自血液中的葡萄糖。血液中葡萄糖含量的高低是糖尿病诊断的重要指标。而且，血液中葡萄糖水平的持续增高会引发一系列并发症，比如视网膜病、神经性疾病和心血管疾病等。近年来，关于血液中葡萄糖含量与胰腺癌、肝癌、结肠癌等癌症的密切关系也受到了广泛关注。因此，已经相继报道了很多检测血液中葡萄糖的方法。

近几年，基于电化学和光学技术的葡萄糖传感器因成本较低的优点，得到了普遍应用；但是此类技术存在信号干扰和灵敏度低的缺点。基于此，凭借高准确度和高灵敏度的优点，色谱-质谱联用的方法被应用到血液中葡萄糖的定量检测中；但是，因为葡萄糖需要经过气相分离或液相分离过程，所以该方法存在耗时的缺点，无法实现高通量。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱具有准确、高通量、高灵敏度和样品消耗量低的优点，有望在血液中葡萄糖的检测方面发挥重要作用，但是该技术在低分子量区域存在基质信号干扰以及信号重现性差的问题，这对血液中葡萄糖的定量检测造成极大的困难。

准确、高通量和低样品用量是临床检测的基本要求。所以，为了获得可靠的临床诊断结果，需要建立一种准确、灵敏和快速的方法对血液中的葡萄糖进行检测。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不足，本发明提供一种准确、高通量和高灵敏度的策略，实现血清中葡萄糖的定量检测。

本发明的第一方面，提供一种定量检测血清中葡萄糖的试剂盒，包括同位素内标[²H₄]葡萄糖、乙腈、结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂。

进一步的，所述结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂是2-(4-苯硼酸)异喹啉氮鎓溴化物或1-(4-苯硼酸)吡啶氮鎓溴化物。

本发明的第二方面，提供一种基于上述试剂盒定量检测血清中葡萄糖的方法，包括以下步骤：

1)除蛋白：准确量取0.5微升血清后将其置于200微升离心管中，加入0.5微升，2毫克/毫升的同位素内标[²H₄]葡萄糖，加入1.5微升乙腈除蛋白，然后以12000rpm转速高速离心1min后取上清液；

2)化学标记：向步骤1)除蛋白后的上清液中加入0.5微升，10毫克/毫升结构中含有硼酸基团和季铵基团的衍生化试剂，然后在700W的微波炉中高火反应3min；

3)制备标准曲线：配制含葡萄糖标准品的溶液，葡萄糖标准品的浓度变化范围为0.02-50mmol/L,其中同位素内标[²H₄]葡萄糖固定为5.56mmol/L，每个浓度的样品做三次平行，按照步骤2)所述进行化学标记后将样品按照浓度从低到高顺序进行黑磷辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析，以浓度为横坐标，以葡萄糖化学标记产物的峰强对同位素内标[²H₄]葡萄糖化学标记产物的峰强的比值为纵坐标，制得工作曲线；