[发明专利]一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞低温冷冻保存，尤其是涉及一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂。

背景技术

人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）具有获取简单和易于培养等优点，作为候选的细胞治疗产品要优于胚胎干细胞或诱导多能干细胞。无论是基础研究还是临床应用（如广泛的退行性疾病和自身免疫疾病等），都需要间充质干细胞具有稳定的功能和充足的供应量。而细胞的低温冷冻保存优势明显且技术成熟，是目前最常用的细胞存储方式。

在低温冷冻过程中，细胞内外环境中冰晶的形成会导致细胞膜的破损，从而造成细胞死亡。这一过程是决定细胞冻存能否成功的关键，而添加合适的低温保护剂是解决冷冻和解冻过程中造成细胞膜损伤的最有效的方式。

传统的细胞冻存液配方主要成分为DMSO，但DMSO具有细胞毒性，特别是胚胎干细胞的冻存复苏率受处理过程及冻存保护剂的影响较大，由于处理方式不同，其冻存复苏率从0.4-5%不等，而干细胞多能性特异标志物Oct4在细胞复苏后则会出现不同程度的缺失。神经干细胞、胚胎干细胞、肿瘤干细胞等需悬浮培养的干细胞则易造成冻存后部分干细胞特异活性标志物的弱化甚至缺失。近期研究发现，将诱导多能干细胞（iPSC）冻存在10%的DMSO中，会导致解冻后多能性的标志物Oct4的表达几乎完全丧失。胎牛血清（FBS）能为细胞冻存过程中提供蛋白质、脂肪和胆固醇等，且能提高冻存效果，作为补充或用于冷冻保存的基础培养基已被广泛使用，但由于其潜在的生物安全性和对受体传播病原体等问题，使用量也不宜过高。此外，海藻糖（Trehalose）是一种天然存在的非还原性二糖，作为非渗透性的低温保护剂，其生物安全性较高，但由于是大分子物质，不能穿透细胞膜，不能有效防止细胞内冰晶的形成，冻存后细胞存活率一般较低。现阶段，国内间充质干细胞冻存保护剂还未有标准化的配方，复苏后的效果也难以控制，国外进口干细胞相关冻存试剂价格昂贵，无法大规模推广于科研应用。因此亟待研发一种具有我国自主产权的高效冻存试剂，亟待开发出标准化的干细胞冻存模式。

MG53蛋白是近年发现的肌肉特异性表达的tripartite motif family (TRIM)蛋白，该家族蛋白常含三个特定模序结构，分别被称为RING指，B-BOX和卷曲结构域，它们共同作用结合在细胞特定蛋白上，进行泛素化降解，是一种重要的细胞膜修复机制。虽然天然的MG53蛋白主要局限于骨骼肌和心肌组织，但新近发现其在多种非肌肉细胞中过表达MG53也具有降低细胞损伤，减少凋亡发生的作用。基因重组的人源MG53蛋白（rhMG53）能定位于损伤部位，对机械外力、化学物质或紫外线等造成的肌肉和非肌肉细胞的损伤，都表现出剂量依赖性的保护作用，生物安全性好。然而，有关MG53在干细胞冻存损伤中的修复作用尚未见研究报道。

发明内容

本发明针对干细胞低温冷冻保存过程中造成的膜损伤和低存活率等问题，提供一种包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，该低温保护剂中的rhMG53具有修复膜损伤的功效，可对冻存复苏过程中的膜损伤发挥保护和修复的作用。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的包含rhMG53的人脐带间充质干细胞低温保护剂，所述保护剂由DMEM/F12培养基、FBS、DMSO和rhMG53配制而成，首先将所述DMEM/F12培养基、FBS和DMSO按体积比5:4:1配制成混合液；然后在该混合液中按30μg/mL之比例添加rhMG53，混合均匀后即得到人脐带间充质干细胞低温保护剂成品，即hUC-MSCs低温保护剂。

本发明配制的hUC-MSCs低温保护液中主要成分的特征为：

1）rhMG53：由于Mitsugumin53（MG53）蛋白是一种骨骼肌和心肌特异表达的Tripartite motif （TRIM）家族蛋白，该家族蛋白常含三个特定结构：RING指，B-BOX和卷曲结构域，它们共同作用结合在细胞特定蛋白上，进行泛素化降解，是一种重要的细胞膜修复机制。

2）DMSO（Dimethyl sulfoxide，二甲基亚砜）：具有高极性、高沸点、热稳定性好、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇等大多数有机物，被誉为“万能溶剂”。

3）DMEM/F12培养基（Dulbecco's modified Eagle medium/F12）：是hUC-MSCs的基础培养基，为干细胞的冻存提供等渗的电解质。