[发明专利]基于硼酸‑二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方 法。

背景技术

氧化还原蛋白质或酶在基底上的固定是不依赖于媒介体的电化学生物传感 器、生物反应器以及其它生物装置的重要前提，并引起了研究者的广泛关注。 在固体表面固定酶或蛋白质并有效实现蛋白质直接电化学的方法之一是将其固 定在修饰于电极表面的薄膜中。在各种制备薄膜的方法中，层层组装 (layer-by-layer,LbL)技术表现出显著的优势，它能够根据预先设计的方案在纳 米或分子层次上控制薄膜的组成与厚度，并且组装程序非常简便。LbL组装的 成膜驱动力逐渐由静电作用力扩展到各种各样的非静电相互作用如离子-偶极 作用力、氢键作用和特异性相互作用等。在各种特异性相互作用中，硼酸基团 和二醇单元之间的相互作用在构筑薄膜方面引起了许多研究者的兴趣。苯硼酸 (phenylboronic acid,PBA)及其衍生物能够与各种1,2-或1,3-顺二醇化合物(如 多元醇、糖类化合物)生成硼酸-二醇间的共价键，并形成五元或六元环状的硼 酯复合物。如聚乙烯醇或甘露糖可以与含有PBA基团的聚电解质构筑LbL薄膜。 一个单糖分子通常含有5个-OH基团，而一个PBA基团可以与两个-OH基团 结合，因此它们可以形成1:2的糖-PBA复合物。葡聚糖(dextran,Dex)是以葡 萄糖为单体的聚多糖，其分子骨架上含有许多可以与PBA基团结合的葡萄糖单 元。虽然Dex和PBA之间的特异性亲和作用已有报道，但是由Dex与含有PBA 基团的聚电解质构筑的蛋白质层层组装薄膜至今未见报道。

目前吸入型蛋白质LbL薄膜已经发展成为一种新型的蛋白质LBL薄膜：将 固体基底表面组装的聚合物和/或纳米粒子LbL薄膜浸泡在蛋白质溶液中，使蛋 白质自发吸入薄膜，形成吸入型蛋白质LbL薄膜。与通常的直接将蛋白质和其 他组分构筑的蛋白质LbL薄膜相比，吸入型蛋白质LbL薄膜中的蛋白质是自发 地扩散进入薄膜内部，并且独立于LbL薄膜的组装过程，因此该方法在保持蛋 白质的原有结构和生物活性方面表现出独特的优点。在电极上构筑不同类型的 吸入型蛋白质LbL薄膜的研究已有报道，并实现了氧化还原蛋白质在该类型薄 膜电极上的直接电化学。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种合成了既含有苯硼酸PBA 基团又含有羧酸基团的聚电解质PAA-PBA的基于硼酸-二醇特异性识别作用的 层层组装薄膜的制备方法。

本发明基于硼酸-二醇特异性识别作用的层层组装薄膜的制备方法，包括：

通过氨基苯硼酸与聚丙烯酸PAA的羧基之间的缩合反应将苯硼酸PBA基 团接枝到聚丙烯酸PAA骨架上，得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA；然后利 用聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA与葡聚糖Dex之间的硼酸-二醇特异性识别作用 在热解石墨PG电极表面上组装{PAA-PBA/Dex}_n LbL薄膜，然后再从溶液中吸 入肌红蛋白Mb，形成{PAA-PBA/Dex}n-Mb薄膜。

进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成包括：

聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA聚电解质是由聚丙烯酸PAA与3-氨基苯硼酸半 硫酸盐APBA在交联剂N-羟基丁二胺磺酸钠NHS和N-(3-二甲氨基丙基)-N′- 乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC存在的条件下发生缩合反应，将PBA接枝到PAA 骨架上而合成的，其合成路线如下式所示：

进一步地，聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA的合成具体包括：

将0.57g的聚丙烯酸PAA水溶液，聚丙烯酸PAA水溶液含有2.77mmol 单体用20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液稀释，将溶液 pH调至8.5；将20mL,61mM的3-氨基苯硼酸半硫酸盐APBA同样溶于pH 8.5的20mL,50mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液中；然后将上述 两种溶液混合；逐滴加入含有4mL,31mM的N-羟基丁二胺磺酸钠NHS的 50mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES缓冲溶液，并搅拌10min；将 含有4mL,310mM的N-(3-二甲氨基丙基)-N′-乙基-碳二亚胺盐酸盐EDC的50 mM,pH 8.5的4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES溶液加入上述反应混合溶液中，室 温下搅拌12h；然后将上述溶液透析一周以除去所有小分子量的杂质，冷冻干 燥后得到产物聚丙烯酸-苯硼酸PAA-PBA，为白色粉末状固体。