[发明专利]一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法

说明书

本发明公开了一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法，包括四个步骤：(1)发酵液酸化；(2)惰性物质破除乳化；(3)乙酸乙酯振荡萃取；(4)离心、吸取上清液提取HSAF。本发明中所添加的惰性物质能够有效地破除乳化问题，所采用的振荡处理使萃取反应时间缩短至1min，极大地提高了萃取速率。本发明最大能够使发酵液中HSAF一次萃取效率达到88.2％，比对照提高了1.83倍，而且操作方便、工艺简单，是国内外首次对HSAF这一具有巨大应用前景的产品提取工艺进行总结。

技术领域

本发明属于分离工程技术领域，具体涉及到一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法。

背景技术

生物农药是指利用生物活体、生物代谢产物或生物特定基因而制成的农药，目前研发和应用较多的有农用抗生素(井冈霉素、阿维菌素等)、微生物农药(苏云金杆菌、假单胞菌等)、植物源农药(苦参碱、除虫菊素等)等。其具有低毒、低残留、不易产生抗药性等优点，为农业可持续发展提供了非常重要的研究方向，具有广阔的前景。

Lysobacterenzymogenes是一种新型的生防细菌，可以分泌多种胞外酶以及各类次生代谢产物，对多种真菌均具有很好的防治效果，且对部分细菌、线虫等也具有抑制效果。其中一种重要的次生代谢产物-热稳定抗真菌因子(Heat Stable Antifungal Factor,HSAF)，其具有热稳定性高(>300℃)、抗菌谱广(真菌、卵菌、细菌、单细胞藻类和线虫等)及毒性低(>5mg/mL才对人体肝脏细胞有毒性)等特点。其结构由一个独特的大环内酰胺体系、一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架组成这一新颖结构不同于目前市场上任何一种杀真菌剂。除此，HSAF对病原真菌的作用方式也与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，它主要是通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。综上所述，HSAF可以代表一类化学结构新颖、作用方式独特，对环境友好的生物杀菌剂或抗菌药物。

目前，对于发酵液HSAF的提取主要采用有机溶剂萃取法。由于发酵液中各种代谢产物，如蛋白质、糖类的存在，使系统极易出现乳化现象，导致相分离困难，产品损失严重。一般采用多次反复萃取的策略，虽然能够回收更多的目的产物，但费时费力，而且增加了生产工序，使生产效率大大降低，给HSAF的实验室研究和工业化生产带来了极大的困难。因此，开发一种高效提取发酵液中HSAF的方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法，包括以下步骤：

(1)发酵液酸化；

(2)加入惰性物质；

(3)加入乙酸乙酯，涡旋混合振荡萃取；

(4)离心、吸取上清液提取HSAF。

本发明步骤(1)所述的发酵液可以为任何HSAF生产菌株发酵产生的的发酵液，优选的，为产酶溶杆菌LysobacterenzymogenesOH11发酵得到的，优选的具体发酵过程为：将活化的菌株OH11接入到LB液体培养基中28℃、180rpm培养12-15h，按照1.0-2.5％接种量转入发酵培养基中，28℃、150-200rpm培养48-60h。

所述的发酵培养基成分为：黄豆粉：8g/L、葡萄糖：8g/L、CaCl₂：0.7g/L。

所述的发酵液中HSAF含量通过HPLC检测，含量为250-400mg/L。