[发明专利]精子顶体酶的快速提取方法及其活性的流式检测方法

说明书

本发明公开了精子顶体酶的快速提取方法及其活性的流式检测方法，特点是提取方法包括将精液加入到离心管中，离心吸去精浆部份，保留下层精子沉淀，然后加入破膜液，使精子沉淀团均匀悬浮后，离心去掉上清，然后加入提取液，使精子悬浮，再离心3收集上清，即获得顶体酶提取物，其活性的流式检测方法为通过多肽或蛋白微球偶联技术和多肽或蛋白荧光标记技术，采用将顶体酶酶切底物进行荧光标记后连接到微球上，一定粒径的荧光微球能被流式细胞仪所识别，荧光强弱直接反应了样本中顶体酶活性的高低，优点是通过快速提取和流式检测结合，使得检测效率大大提高，增加了检测的灵敏性。

技术领域

本发明涉及一种精子顶体酶的提取技术，尤其是涉及一种精子顶体酶的快速提取方法及其活性的流式检测方法。

背景技术

人类精子进入女性生殖道后，必须经过一段成熟过程，获得受精能力，此期间精子所发生的一系列生理变化称为获能。获能后的精子穿过卵丘、放射冠，到达透明带时，经过精卵识别、质膜变化、顶体酶释放、透明带酶解，精子细胞核进入卵细胞与核相溶，这一系列复杂的过程构成了广义上的顶体反应，而狭义顶体反应主要包括透明带诱发的质膜融合与顶体酶的释放两个关键过程。目前的实验室研究以及临床诊断最关注的也是这两个过程的分子机制和临床检测。其中质膜融合主要检测方法是通过体外模拟诱发精子顶体膜发生变化，并利用特异性染色的方法进行观察，顶体酶释放过程主要关注释放出的酶的活性检测。顶体酶存在于精子顶体内膜及赤道部膜上，它是受精过程中重要的蛋白水解酶，通常以无活性的酶原形式存在于顶体内。当精子头部进入卵透明带时，顶体酶原被活化为顶体酶水解卵透明带，使精子穿过卵透明带最终与卵子融合。顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标。同时，因顶体酶活性越高，精子穿透能力就越强，故将其作为辅助生殖技术(ART)助孕方式选择的评价指标之一。顶体酶活性定量检测是辅助生殖中心常用的检测项目。

顶体酶的检测最开始是利用顶体酶抗体进行放射免疫法或荧光免疫法进行检测，通过观察精子顶体内顶体酶的数量判断精子受精的能力。由于此方法具有很多局限性，后来Kennedy等人发现了一种能够被顶体酶所酶切的底物，Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐酸盐(BAPNA)，此底物被顶体酶水解后能够显色，通过将精子顶体酶提取，然后酶切BAPNA底物，通过最终反应体系颜色的深浅来判断顶体酶活性的高低。该方法得出的指标更能反应精子顶体酶的生理功能，现已成为男科学实验室的普遍检测方法。但由于精子样本中顶体酶本身的活性并不高，通常为μIU级别，因此对于一些酶活较低的样本存在灵敏度不够高难以准确定量的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种实现精子顶体酶的快速释放和分离的精子顶体酶的快速提取方法，同时提供一种灵敏度高，检测速度快的精子顶体酶活性的流式检测方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种精子顶体酶的快速提取方法，包括以下步骤：

(1)将含有7.5*10⁶个精子数目的精液加入到离心管中，于10000rpm离心2min，吸去离心后管内的精浆部份，保留下层精子沉淀；

(2)在含有精子沉淀的离心管中加入200uL破膜液，使精子沉淀团均匀悬浮后，于7000rpm离心2min后，去掉上清，然后加入400uL提取液，使精子于37℃悬浮10min，再于12000rpm离心3min后，收集上清，即获得顶体酶提取物，其中每100ml破膜液中含磷酸二氢钠1.2g，Triton-1000.2-0.4ml和叠氮钠0.05g；每100ml提取液中含BSA 1g、氯化钠0.35g、磷酸一氢钠1.19g、二水磷酸二氢钠0.25g和叠氮钠0.05g。