[发明专利]真菌人工染色体、组成、方法和用途

权利要求书

1.一种真菌人工染色体(FAC)，其包含：

低拷贝数细菌复制起点oriS；

诱导型高拷贝数细菌复制起点oriV；

细菌选择标记基因；

真菌选择标记基因；

AMA1真菌自主复制元件；

克隆位点，其包含彼此相邻、方向相反的一对BstXI位点和位于所述一对BstXI位点侧翼、方向相反的两个I-SceI归巢限制性位点；

attP位点；

真菌密码子优化的phi31整合酶基因；和

可操作地连接到整合酶基因的序列为SEQ ID NO：15的真菌诱导型启动子alcA(p)。

2.一种真菌人工染色体(FAC)，其包含：

低拷贝数细菌复制起点oriS；

诱导型高拷贝数细菌复制起点oriV；

细菌选择标记基因；

真菌选择标记基因；

AMA1真菌自主复制元件；

克隆位点，其包含彼此相邻、方向相反的一对BstXI位点和位于所述一对BstXI位点侧翼、方向相反的两个I-SceI归巢限制性位点；

相同方向的两种真菌DNA序列，其中所述两种真菌DNA序列各自与宿主真菌DNA序列同源，所述两种真菌DNA序列为SEQ ID NO：12的1,000bp的3'trpC和SEQ ID NO：13的1,007bp的5'-tpC同源序列。

3.根据权利要求1或2所述的真菌人工染色体，其中所述细菌选择标记基因选自氯霉素抗性基因(camR)、kanR、ampR、genR、tetA、strepR、galK及其组合。

4.根据权利要求1或2所述的真菌人工染色体，其中所述真菌选择标记基因选自pyrG、ptrA、trpC及其组合。

5.根据权利要求1或2所述的真菌人工染色体，其还包含至少20kb插入物。

6.根据权利要求1或2所述的真菌人工染色体，其还包含至少100kb插入物。

7.根据权利要求1或2所述的真菌人工染色体，其还包含至少一种次生代谢物(SM)基因簇。

8.一种非偏倚FAC文库构建方法，其包括：

提供来自真菌的高分子量(HMW)基因组DNA；

将所述HMW基因组DNA机械剪切成100kb-300kb长度的片段；

在所述DNA片段上产生平末端；

将BstXI接头连接到所述平末端，以此产生接头连接的DNA片段；

通过脉冲场凝胶电泳纯化所述接头连接的DNA片段；以及

将所述纯化的接头连接的DNA片段连接进入BstXI-酶切的、权利要求1-7任一项的真菌人工染色体(FAC)。

9.一种在次生代谢物(SM)基因簇中的靶位点处缺失DNA序列的方法，其包括：

提供权利要求7所述的真菌人工染色体(FAC)；

提供缺失DNA，其包括a)与靶DNA序列第一侧的侧翼序列同源的第一序列，b)与靶DNA序列第二侧的侧翼序列同源的第二序列，和c)细菌选择标记；

转化真菌人工染色体并将DNA插入表达Red/ET重组酶的大肠杆菌菌株；和

选择包含细菌选择标记的转化的大肠杆菌细胞。

10.一种将DNA序列插入次生代谢物(SM)基因簇中的靶位点的方法，其包括：

提供权利要求7所述的真菌人工染色体(FAC)；

提供插入DNA，其包括a)与靶位点第一侧的侧翼序列同源的第一序列，b)待插入序列，c)与靶位点第二侧的侧翼序列同源的第二序列，和d)细菌选择标记；

转化FAC并将DNA插入表达Red/ET重组酶的大肠杆菌菌株；和

选择包含细菌选择标记的转化的大肠杆菌细胞。