[发明专利]一种检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物蛋白检测领域，更具体地说，本发明涉及一种高通量检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法。

背景技术

p53是人体重要的肿瘤抑制因子，被称为“基因组卫士”。它在G1期检查DNA损伤，通过转录活性调控细胞DNA修复、生长周期阻滞、凋亡等，以维持细胞正常功能。野生型p53蛋白由393个氨基酸组成，蛋白分子量为53KD，包括以下几个结构域：N端转录激活域、脯氨酸富集区域、DNA结合结构域、四聚化结构域和C端无结构的碱性结构域。作为迄今发现与人类肿瘤相关性最高的蛋白，在约50％的肿瘤中因受到负调控蛋白，比如MDM2和MDMX，的抑制而不能发挥正常功能，其中与p53转录激活域结合使其失活是重要的机制之一。在表达野生型p53的肿瘤中，通过抑制负调控蛋白与p53转录激活域的结合释放活性p53蛋白已成为抗肿瘤药物设计的热门靶点之一。为了释放肿瘤细胞中p53转录激活域从而恢复野生型p53活性，寻找与p53转录激活域相互作用蛋白并开发相应抑制剂具有重要的临床治疗意义。

近些年来，随着蛋白质组学研究技术的不断发展，研究蛋白质相互作用的新方法不断涌现，除了传统的大家已经熟知的技术，比如免疫共沉淀、GST-Pull down、酵母双杂交等，目前国内外发展了一些新的技术，比如串联亲和纯化技术、表面等离子共振等。纵观现有技术各有优缺点：免疫共沉淀作为经典的分析生理条件下蛋白质间相互作用操作简单应用广泛，但步骤繁琐无法大规模筛选相互作用蛋白；GST-Pull down是体外验证蛋白质相互作用的常用技术，该技术特异性强但是不适合大规模筛选；酵母双杂交技术可以分析已知蛋白质之间的相互作用而且还可以用来筛选未知蛋白的基因，虽然该方法适合大规模筛选相互作用蛋白但易出现假阳性等；串联亲和纯化技术很好的克服了酵母双杂交技术的假阳性并且可大规模地研究细胞水平的蛋白互作网络，但这一技术引入的TAP标签可能会影响靶蛋白与亲合柱的结合等；表面等离子共振技术无需标签修饰，而且检测灵敏度高，能够实时高效测定蛋白质之间的相互作用，但是虽然这一技术有着精度高检测速度快等优势但对样品要求高，价格昂贵，普遍适用性低。总之，这些方法虽然可以满足科研要求，但一定程度上存在各自的不足，不利于经济高效地检测p53转录激活域与蛋白质间的相互作用。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术中存在的不足，提供一种高通量检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，其包括如下步骤：

(1)将人源p53编码序列插入真核表达载体pENTER中，得到pENTER-p53重组质粒；

(2)将步骤(1)所得pENTER-p53重组质粒转染HEK 293T细胞；

(3)用细胞裂解液裂解步骤(2)所述细胞，离心取上清，得到含有p53-His重组蛋白的细胞裂解液；

(4)制备包被有p53单克隆抗体的发光微球和生物素化的His标签抗体；

(5)在反应孔中加入样品，然后依次加入步骤(3)所述含有p53-His重组蛋白的细胞裂解液、步骤(4)所述包被有p53单克隆抗体的发光微球和生物素化的His标签抗体混合反应，再加入链霉亲和素包被的感光微球混合反应；

(6)使用光激化学发光分析仪测量反应孔的光信号值，根据光信号值即可检测样品中是否存在与p53转录激活域相互作用的蛋白。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，步骤(2)中，所述离心的条件为15000～20000g，离心时间为10～30min。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，步骤(3)中，所述细胞裂解液的用量为每10⁷个细胞添加0.5～1mL。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，步骤(4)中，所述包被有p53单克隆抗体的发光微球中，p53单克隆抗体与发光微球的质量比为1～2:10。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，所述p53单克隆抗体的抗原肽为人源p53N端1～100氨基酸。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，所述发光微球的直径为100～400nm。

作为本发明检测细胞内与p53转录激活域相互作用蛋白的方法，步骤(4)中，所述生物素化的His标签抗体中，生物素与His标签抗体的质量比为10:1。