[发明专利]一种三维荧光差分超分辨显微方法及装置

权利要求书

1.一种三维荧光差分超分辨显微装置，包括激光器、承载待测样品的电动样品台和将光线投射到所述电动样品台的显微物镜，其特征在于：

所述的激光器和显微物镜之间依次设有：

用于将所述激光器发出的光束改变为线偏振光的起偏器；

用于调制所述线偏振光偏振方向的第一二分之一波片；

用于依次调制光束水平分量和垂直分量的空间光调制模块；

用于对圆偏振光进行光路偏转的扫描振镜系统，由所述扫描振镜系统出射的圆偏振光经显微物镜投射到待测样品上；

还包括采集待测样品发出的信号光的探测系统，以及控制所述空间光调制模块和扫描振镜系统的计算机；

所述的空间光调制模块包括：

空间光调制器，由所述计算机控制加载黑色背景或同时加载0～π相位调制图案和0～2π涡旋相位调图案；

反射镜，用于将空间光调制器反射的光束再次反射进入空间光调制器内；

位于所述空间光调制器和反射镜之间的第一四分之一波片，用于将两次经过的光束的偏振方向转过90度。

2.如权利要求1所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：所述的空间光调制模块和扫描振镜系统间设有用于将偏振光转换为圆偏振光的第二二分之一波片和第二四分之一波片。

3.如权利要求2所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：由所述第一二分之一波片出射的光束经一D形反射镜后入射至空间光调制模块。

4.如权利要求2所述的三维荧光差分超分辨显微装置，其特征在于：所述的探测系统包括：

布置在第二四分之一波片和扫描振镜系统间的分束镜，

用于探测信号光束的光强信号的探测器，

用于将滤光后的信号光束聚焦到探测器上的聚焦透镜，

和用于对所述信号光束进行空间滤波的空间滤波器。

5.一种基于权利要求1～4任一项所述三维荧光差分超分辨显微装置实现的显微方法，其特征在于，包括步骤：

1)激光器发出的激光光束在准直后转换为线偏振光；

2)调节第一二分之一波片，使光束的偏振方向与空间光调制器可调节偏振方向成α角；

3)将偏振光入射至空间光调制器的屏幕一侧，利用该侧加载的0～π相位调制图案对偏振光进行相位调制；

4)控制空间光调制器反射后的光束重新折返入射至空间光调制器的屏幕另一侧，利用该侧加载的0～2π涡旋相位调图案进行相位调制；

5)两次调制后的激光光束在转化为圆偏后经扫描振镜系统和显微物镜聚焦到样品上并进行扫描；

6)在扫描过程中实时收集被测样品各被激发点发出的信号光，得到一次扫描信号光强I₁(x,y,z)；

7)将步骤3)和步骤4)内的空间光调制器上仅加载黑色背景，重复步骤3)～6)，对相同的三维空间进行第二次扫描，得到二次扫描信号光强I₂(x,y,z)；

8)根据公式I(x,y,z)＝I₂(x,y,z)-r×I₁(x,y,z)计算最终信号光强I(x,y,z)，并利用I(x,y,z)得到超分辨图像；其中r＝I₂^max/2×I₁^max，I₂^max为I₂(x,y,z)的最大值，I₁^max为I₁(x,y,z)中的最大值。

6.如权利要求5所述的显微方法，其特征在于，当待测样品为荧光样品时，所述信号光为圆偏振光经显微物镜投射后在样品上激发出的荧光；当待测样品为非荧光样品时，所述信号光为圆偏振光经显微物镜投射后经样品表面的反射光束。

7.如权利要求5所述的显微方法，其特征在于，若最终信号光强I(x,y,z)为负值时，令I(x,y,z)＝0。

8.如权利要求5所述的显微方法，其特征在于，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.49。

9.如权利要求5所述的显微方法，其特征在于，在步骤2)中，调节第一二分之一波片的快轴，使得光束的偏振方向与水平方向夹角为54.5度。