[发明专利]一种人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系CAF-SA的建立方法及其应用

说明书

本发明构建了一种唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系，该细胞系的构建为唾液腺腺样囊性癌研究及抗肿瘤药物开发提供了研究基础。该细胞系的构建主要采用多次的有限稀释法筛选稳定细胞株，通过细胞免疫荧光鉴定，上皮细胞标记物Cytokeratin spectrum阴性，间质细胞标记物Vimentin阳性，同时高表达癌相关成纤维细胞的多种生物标记物FAP、FSP‑1。该细胞系被证明可连续传代培养40代以上。通过划痕实验、Transwell小室侵袭实验、微流控芯片诱导实验、小管形成实验及裸鼠皮下移植瘤实验验证该细胞系在唾液腺腺样囊性癌研究中的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体提供一种人唾液腺腺样囊性癌来源的癌相关成纤维细胞系及其构建方法，并提出细胞系的应用价值。

背景技术

1.唾液腺腺样囊性癌

唾液腺腺样囊性癌(Salivary adenoid cystic carcinoma，简称SACC)占口腔颌面部恶性肿瘤的27％，好发于腮腺及舌下腺。SACC病程发展缓慢，主要致死原因为SACC的嗜神经侵袭及远端器官转移。

2.肿瘤微环境

肿瘤的发生发展受到多种因素的调控，其中肿瘤微环境作为重要的调控因素得到深入研究。肿瘤微环境指肿瘤细胞、间质细胞、可溶性细胞因子等及其周围的细胞外基质包裹共同形成的微环境。肿瘤微环境中存在多种类型的间质细胞，包括成纤维细胞、癌相关成纤维细胞、血管内皮细胞、骨髓来源的间充质干细胞及免疫细胞。其中癌相关成纤维细胞是较为重要的细胞类型。

3.癌相关成纤维细胞的来源及研究现状

3.1癌相关成纤维细胞(Carcinoma-associated fibroblasts，简称CAFs)，通过激活自分泌及旁分泌信号，参与肿瘤的侵袭转移。CAFs来源广泛，主要包括以下途径：(1)宿主成纤维细胞激活；(2)上皮细胞间充质转化；(3)血管内皮细胞。由于CAFs的来源复杂，鉴定CAFs时常通过多种生物学标记物联合使用。现阶段CAFs的生物学标记物为：平滑肌肌动蛋白-α、成纤维特异性蛋白、成纤维活化蛋白。CAFs参与肿瘤的发生发展。Chen等发现肺癌来源的CAFs通过分泌胰岛素样生长因子II/胰岛素样生长因子受体，激活Nanog旁分泌途径调控肿瘤干细胞的生长。转移方面，研究人员发现CAFs通过分泌MMPs及趋化因子，重构肿瘤细胞所处的ECM并促进肿瘤细胞的定向迁移能力。

3.2SACC来源的CAFs研究现状

近年来，研究人员已经证实SACC中存在CAFs细胞，并参与SACC的侵袭及转移。Lijiao等通过原代提取联合多重生物学标记物提取鉴定CAFs。通过微流控芯片技术发现，SACC来源的CAFs位于肿瘤细胞前沿，构建侵袭通道促进定向侵袭。

4.细胞株的构建

细胞株是生物学体外研究不可或缺的研究对象，是指经过原代提取并能长期传代培养的细胞，传代数不低于40代。细胞株的构建方法常为以下两种：(1)细胞选择法；(2)单细胞克隆法。成功构建的细胞株需要进行多种生物学特征的验证，包括：(1)细胞株亲源DNA指纹鉴定；(2)细胞株形态学成像及组织特异性抗原鉴定；(3)生长及增殖能力鉴定；(4)支原体等污染源排除。

发明内容

本发明的目的是建立人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系CAF-SA，并提出其生物医学研究中的应用价值。

本发明中所述人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系CAF-SA已经在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，保藏日：2017年3月29日，保藏编号：CCTCC NO:C201745。

本发明中人唾液腺腺样囊性癌癌相关成纤维细胞系CAF-SA的建立包括以下步骤：