[发明专利]一种超耐Mn2+的细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂、复合酶系及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种超耐Mn²⁺的细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂、复合酶系及其制备方法与应用，属于生物技术领域。本发明来源于宏基因组的细菌漆酶lac1542，编码该漆酶的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该细菌漆酶以ABTS为底物时最适pH为4.0；最适反应温度为75℃且高温下稳定性强；100mmol/L的Mn²⁺仍能对该酶起激活作用；该细菌漆酶和锰过氧化物酶、灰盖鬼伞过氧化物酶组成复合酶系在低浓度下即可降解木质素达71.5％；该细菌漆酶和灰盖鬼伞过氧化物酶复合酶系对甲基橙的脱色率达到54.8％。本发明的细菌漆酶可作为一种新的酶源用于造纸、染织和环保领域，具有广阔的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及一种超耐Mn²⁺的细菌漆酶、重组载体、重组菌、酶制剂、复合酶系及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

漆酶(laccase)是一种含铜的多酚氧化酶，具有氧化多酚、有毒的芳胺类，染料脱色及分解木质素等作用，一直是生物学、化学和环境科学领域的研究热点；在木质素降解、纸浆漂白、有机污染物处理等领域得到了广泛的研究与应用。二十世纪八十年代以前，漆酶主要是从植物或真菌中直接分离，得率低、成本高。随着分子生物学技术的发展，为克隆漆酶基因实现异源表达、工业化生产提供了可能。1988年Fronhman等首次利用快速扩增 cDNA技术从白腐菌糙皮侧耳(P.ostreatus)中克隆到漆酶pox1基因，后来的研究者多用RT －PCR技术来获得漆酶基因。过去认为漆酶仅仅存在于植物和真菌中，因此关于漆酶的研究主要集中在真菌漆酶中。为了研究真菌漆酶的功能、异源表达、产生和调控机制，目前已有超过40种以上的真菌漆酶基因被克隆并且进行了广泛而深入的研究。然而，近年来Alexandre等通过对蛋白质数据库及细菌基因组进行同质性分析，发现漆酶广泛存在于原核生物中。细菌漆酶的广泛存在，为漆酶的研究开拓了新的领域，增加了新的种类和资源。尤其令人感兴趣的是，和真菌漆酶相比细菌漆酶在某些酶学性质方面具有优势比如Cu²⁺抗性、不需糖基化、热稳定性好及酶的最适pH值范围广等优点。

目前已经发现的具有laccase-like活性的细菌并不多，从中分离、鉴定、纯化并描述其漆酶性质更少。由于可培养的微生物仅占微生物种类的不到1％，因此从可培养的微生物中克隆的漆酶种类非常有限。宏基因组技术的产生为从不同自然生境的未培养微生物中寻找新的漆酶基因资源提供了有力的技术手段。

单一的漆酶无论是在木质素降解还是环境治理方面效率都不高，研究证明由漆酶和锰过氧化物酶(Manganese peroxidase Mnp)组成的复合酶系可以高效地降解木质素、染料脱色。然而，不幸的是锰过氧化物酶发挥活性往往依赖于Mn²⁺的存在；而大量文献报道Mn²⁺对多种漆酶活性有抑制作用。现实生产中造纸和染料工业的反应往往在高温下进行，普通的酶很难适应工业化应用。目前能同时耐受高温和高浓度Mn²⁺的细菌漆酶较少。叶茂等利用宏基因组手段从红树林分离到一个碱性漆酶并对该酶进行了定向进化，但是该酶受Mn²⁺抑制，低浓度的Mn²⁺即可使酶活性降低至70％；以愈创木酚为底物最适反应温度为55℃，该温度下处理30min，活性仅剩余20％。

公开号为CN106434707A的中国发明专利公开了一种来源于枯草杆菌ZNXH4的细菌漆酶基因、细菌漆酶及其应用，但是仅能耐受10mM的Mn²⁺。因此寻找耐热、耐受Mn²⁺的漆酶是提高lac/Mnp复合酶系降解能力、拓宽漆酶工业应用领域的重要途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌漆酶，该漆酶能够耐受高温和高浓度Mn²⁺和Cu²⁺，并能与锰过氧化物酶、灰盖鬼伞过氧化物酶联合降解木质素，脱色染料。

本发明还提供了包含编码上述细菌漆酶的基因片段的重组载体。