[发明专利]培养容器的制造方法和固相化装置

说明书

本申请是申请日为2014年12月16日、申请号为201480057477.1、发明名称为“培养容器、淋巴细胞的培养方法、培养容器的制造方法和固相化装置”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及细胞的培养技术，特别涉及用于培养淋巴细胞的培养容器、和淋巴细胞的培养方法、固相化有蛋白质的培养容器的制造方法和固相化装置。

背景技术

近年来，在医药品的生产、基因治疗、再生医疗、免疫疗法等领域中，要求在人工环境下高效地大量培养细胞和组织、微生物等。

这样的状况下，在包含透气性膜的培养袋中封入细胞和培养液，在封闭系统中大量培养细胞。

但是，为了使淋巴细胞增殖，最初需要使淋巴细胞活化。因此，在固相化有抗CD3抗体的基材上使淋巴细胞活化，之后将活化的淋巴细胞封入培养袋进行增殖。

此时，一般如图8所示，为了使淋巴细胞活化而使用在底面固相化有抗CD3抗体的烧瓶，在淋巴细胞被活化后，转移至培养袋中，进行淋巴细胞的培养。这样操作的理由是，由于淋巴细胞具有如下的性质：为了进行增殖，需要抗CD3抗体所致的刺激，另一方面，若持续受到抗CD3抗体所致的刺激，则会变得难以进行增殖。因此，在淋巴细胞活化后，需要在没有固相化有抗CD3抗体的容器中进行培养。

作为用于使淋巴细胞活化的培养容器，例如可举出专利文献1所述的封闭系统细胞培养容器等。该封闭系统细胞培养容器在容器内的整个面上固相化有抗CD3抗体(0048段、0057段)，能够高效地使淋巴细胞活化。

另外，如上所述，淋巴细胞的活化一般使用抗CD3抗体来进行。即，在固相化有抗CD3抗体的容器内进行淋巴细胞的活化，然后将活化了的淋巴细胞封入未固相化有抗CD3抗体的培养袋内进行淋巴细胞的增殖。

因此，在活化淋巴细胞之前，在用于活化淋巴细胞的容器内需要固相化(涂布)抗CD3抗体。

作为现有的固相化的方法，一般地说为：在含有抗CD3抗体的溶液中浸渍烧瓶内的底面并将其静置后，除去该溶液，由此进行抗CD3抗体的固相化。

具体地，例如专利文献2中记载了：在烧瓶内的底面均匀地浸渍抗CD3抗体，在冰箱中保存过夜后，去除抗CD3抗体，制备抗体固相化烧瓶(0035～0036段、图1)。

另外，专利文献1中记载了：将溶解有抗CD3抗体的溶解液封入容器的收容部，静置规定时间，由此将抗CD3抗体固相化到容器的膜表面(0015段、图1)。

专利文献1：日本特开2007-175028号公报

专利文献2：日本专利第4399710号公报

发明内容

发明要解决的课题

然而，在仅使用专利文献1中记载的封闭系统细胞培养容器进行淋巴细胞培养的情况下，在淋巴细胞活化后也会持续受到抗CD3抗体所致的刺激，因此淋巴细胞受到过量刺激而使增殖受到抑制。因此，为了大量高效地培养淋巴细胞，期望使用该封闭系统细胞培养容器作为活化专用容器，在另外的培养容器中进行细胞的增殖。

因此，该现有技术在要大量高效地培养淋巴细胞的情况下，存在转移活化了的细胞的繁杂性、产生污染风险的问题。

因此，本发明人等经过广泛深入的研究开发了一种用于培养淋巴细胞的培养容器，其包含透气性膜，仅在相对的容器内表面的一个面固相化有抗CD3抗体，，具有固相化面和非固相化面。而且，以使固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的活化，然后以使非固相化面成为底面的方式配置培养容器进行淋巴细胞的增殖，由此能够成功地在单一的容器内高效地进行淋巴细胞的活化和增殖。

即，本发明的目的在于提供能够通过单一的培养容器高效地进行淋巴细胞的活化和增殖的培养容器、和淋巴细胞的培养方法。

另外，专利文献1、2中记载的现有固相化方法中存在如下的问题：为了使抗体充分地固相化而需要很长的静置时间。

进一步，现有方法中存在如下的问题：由于大部分抗体未吸附到容器内而残留在溶液中，因此必须使用量大于固相化量的抗体。例如如后所述存在如下的问题：在将通过现有方法封入有抗体的容器静置1小时的情况下，吸附到容器内的抗体为10％左右，其余约90％未固相化于容器而被废弃。

在此，抗体等蛋白质不耐热，若在高温条件下使其进行吸附，则其功能丧失，因此是不易固相化于容器的材料。另一方面，期望使用少量蛋白质在短时间内实现必要量的固相化。另外，抗体一般而言是高价的，因此期望降低无端废弃的量。