[发明专利]一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于细胞保存技术领域，具体涉及一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法。

背景技术：

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄赠、交换和运送某些细胞。冻存细胞经典方案往往是使用胎牛血清(FBS)与二甲基亚砜(DMSO)混合培养基后，应用于细胞的冻存。但是该方法有不少瑕疵。如，血清中的蛋白甚至潜在的病原体污染会对生物制品的安全性造成风险；此外胎牛血清会对动物造成一定潜在伤害，可能遇到无法通过欧美伦理审核的难题。

发明内容：

本发明公开了一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法，制备的即用型细胞冻存液，能有效地提高常规细胞、原代细胞与干细胞的复苏后存活率与活力；产品质量稳定可靠、使用方便，助力科研工作者摆脱程序繁琐、操作复杂、容易污染的传统冻存方法，专注于后续实验研究；本发明的细胞冻存液所含化学成分明确，无动物源性成分，可一步实现细胞冻存并长期在-80℃冰箱保存，保护细胞免受冰晶和溶质损伤。

为达到上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种不含蛋白和血清的细胞冻存液，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：

质量分数为1％-3％的聚乙烯醇、质量分数为2.5-3.5％的葡萄糖、质量分数为0.15-0.20％的氯化钠、质量分数为0.005-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.03-0.06％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为5％-12％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。

优选的，所述不含蛋白和血清的细胞冻存液包括以下质量分数或体积分数的组分：

质量分数为1.5％-2.5％的聚乙烯醇、质量分数为2.8-3.2％的葡萄糖、质量分数为0.18-0.20％的氯化钠、质量分数为0.006-0.008％的磷酸二氢钠、质量分数为0.035-0.055％的磷酸氢二钠、质量分数为0.04-0.06％的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；质量分数0.002-0.005％的乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、体积分数为7％-10％的二甲基亚砜；其余为双蒸水。

上述技术方案中，所述聚乙烯醇的分子量为40000-60000。聚乙烯醇外观为白色粉末，是一种水溶性高分子聚合物，具有极高的安全性的有机物，对细胞无毒，无副作用，在本发明中加入聚乙烯醇的高分子聚合物能够在细胞冻存温度降低时起到缓冲作用；加入了葡萄糖，为细胞冻存时提供能量，此外其他为缓冲液，为细胞冻存时提供合适的离子平衡和pH等环境。

本发明还公开了上述不含蛋白和血清的细胞冻存液的制备方法，包括以下步骤：

(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；

(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液。

优选的，所述过滤为将所述混合液依次用0.45um滤膜、0.22um滤膜过滤。先用0.45um滤膜经行澄清过滤，然后再进行0.22um过滤除菌，即获得无血清和蛋白来源的细胞冻存液，无杂质污染。

本发明进一步公开了上述不含蛋白和血清的细胞冻存液在保存细胞中的应用。

本发明还公开了一种冻存细胞的方法，包括以下步骤：

(1)在容器中，加入双蒸水，然后加入聚乙烯醇，搅拌使其充分溶解；然后依次加入葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，搅拌；再加入二甲基亚砜，搅拌得到混合液；

(2)在无菌条件下将所述混合液过滤，得到不含蛋白和血清的细胞冻存液；

(3)将细胞悬浮液置于离心管中，离心处理后弃上清、收集培养细胞沉淀；然后加入细胞冻存液，制成细胞混合液；然后将细胞混合液置入-80℃，完成细胞冻存。