[发明专利]基于背景荧光猝灭‑免疫层析测定牛奶中林可霉素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及牛奶检测技术领域，是一种基于背景荧光猝灭-免疫层析测定牛奶中林可霉素的方法。

背景技术

林可霉素(Linconycin，LIN)属于林可胺类抗生素，对于革兰氏阳性菌有较强抗菌作用，对支原体也有抑菌作用，但对革兰氏阴性菌无效。临床上主要应用于葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎球菌及厌氧菌所致的呼吸道感染、皮肤软组织感染、女性生殖道及盆腔感染和厌氧菌所致的腹腔感染等。还可用于链球菌和葡萄球菌所致的败血症、骨和关节感染、慢性骨和关节感染的外科辅助治疗、葡萄球菌所致的急性血源性骨髓炎等。作为兽药，常被添加在饲料中或直接乳房注射治疗奶牛的乳房炎，但残留在乳腺管中的林可霉素，会经乳汁排出，导致生鲜乳中抗生素残留，对消费者引起机体的过敏反应或抗药性。各国都对其有限量要求，中华人民共和国农业部公告第253号-2002牛奶中最高残留限量为100ng/mL。

在进出口动物源性食品SNT2218-2008中林可胺类药物残留量检测方法中林可霉素的检测方法为液相色谱-串质谱法和质谱法。在中华人民共和国国家标准GB/T4789.27-2008规定鲜乳中林可霉素残留的检验方法为嗜热链球菌抑制法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法。文献报道有酶联免疫吸附法(ELISA)、高效液相色谱法、胶体金免疫层析法等。嗜热链球菌抑制法和嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法试验价格低廉，但样品前处理过程繁琐，重现性差；高效液相色谱法、液相色谱串联质谱法等，这类方法灵敏度高，特异性好，但是此类仪器没有便携性，价格昂贵，样品前处理复杂；ELISA方法灵敏度较高、快速、经济，但在检测实验过程需多次洗板，重复性较差，试剂需低温保存等，适用于实验室大量样本初筛，不适合现场快速检测；胶体金免疫层析因快速、简便且经济实用，在食品检测的大量样本筛查中表现出较强的优势，但只能用于定性检测，而不能进行定量，筛选后的阳性样本需送实验室进行进一步定量分析。

发明内容

本发明提供了一种基于背景荧光猝灭-免疫层析测定牛奶中林可霉素的方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有鲜乳中林可霉素残留的检验方法存在样品前处理过程繁琐、重现性差、不适合现场快速检测和不能进行定量分析的问题。

本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种基于背景荧光猝灭-免疫层析测定牛奶中林可霉素的方法，按下述步骤进行：第一步，将林可霉素标准曲线方程和名称输入二维码制码器，制成林可霉素二维码，然后把林可霉素二维码粘贴在林可霉素试纸条上的二维码粘贴处，得到林可霉素检测卡；第二步，取待检测样品200μL至固定有金标抗体的小试杯中，充分混匀后吸取100μL滴加至林可霉素检测卡上的加样孔内，室温下层析10min；第三步，层析后将林可霉素检测卡插入荧光免疫分析仪的插卡口，点击测样，荧光免疫分析仪的显示屏上就会显示出待检测样品名称和待检测样品中林可霉素的浓度。

下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：

上述林可霉素标准曲线方程按下述方法得到：第一步，林可霉素储备液的配置，取林可霉素标准物质，用PBS配成1μg/mL的林可霉素溶液，得到林可霉素储备液；第二步，林可霉素系列浓度标准溶液的配置，将林可霉素储备液用标准牛奶样依次配成10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL和60ng/mL的林可霉素系列溶液，得到林可霉素系列浓度标准溶液；第三步，取标准牛奶样200μL、林可霉素系列浓度标准溶液各200μL至固定有金标抗体的小试杯中，充分混匀后吸取100μL滴加至林可霉素试纸条上的加样孔内，室温下层析10min；第四步，层析后将林可霉素试纸条插入荧光免疫分析仪的插卡口，点击测样，荧光免疫分析仪扫描林可霉素试纸条上的T线和C线，获得样品F₁/F₀的比值；第五步，以溶液中林可霉素的浓度为横坐标，相对应的F₁/F₀为纵坐标，得到林可霉素标准曲线方程y＝-5×10^-6x³+0.0004x²+0.0016x+0.4892。

上述标准牛奶样为经检测不含有林可霉素的牛奶样。

上述待检测样品为待检测牛奶。

本发明测定牛奶中林可霉素的检测限为0.088μg/kg，最优加样量为100μL，最优层析时间为10min；本发明较现有方法灵敏度高、反应时间短、操作简便，可实现牛奶中林可霉素现场快速定量检测，为广泛应用于食品安全领域奠定了基础。

附图说明