[发明专利]一种牛源肌酸激酶同工酶胶体金免疫层析快速检测试纸条

说明书

技术领域

本发明涉及胶体金免疫层析快速检测领域，具体涉及一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)胶体金免疫层析快速检测试纸条及方法。

背景技术

近年来我国奶牛业发展十分迅速，然而不孕症对奶牛养殖业的发展有着重要的影响。大量资料表明，不孕症占奶牛疾病的20％～30％，子宫内膜炎占不孕症的40％～60％。引起奶牛子宫内膜炎的病因较多，但主要原因是产后的早期感染所致，有研究表明奶牛产后的早期阶段有93％的牛发生子宫感染细菌，到46-60天时感染率降低到39％。

奶牛子宫内膜炎使受精卵不能着床或胚胎早期死亡，延迟了产犊间隔，严重影响奶牛的繁殖和生产能力及效率，给奶牛生产造成极大的经济损失。据资料报道，美国每年有12.19％的奶牛由于不孕症或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕症损失高达2.7亿美元；北京农业大学对北京、南京、上海等16个城市调查，子宫内膜炎占不孕奶牛的68.34％，国内每年淘汰的不孕奶牛占淘汰总数的60％-70％。

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK；EC 2.7.3.2)分子量81000～82000Da，是由两个亚基(M和B)组成的二聚体，可逆催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，在肌酸和磷酸肌酸的转化反应中起着重要的作用。比如在能量代谢最旺盛的肌肉组织和脑组织中，CK的活性是最高的。在内脏器官中，子宫是CK第三活跃的器官，头两位是骨骼肌和心肌。根据其同工酶亚基和分布位置的不同，在牛中存在有三种CK同功酶，其中：CK-MM(特异存在于骨骼肌)、CK-MB(特异存在于心肌)和CK-BB(从牛脑中获得)。以上这些同功酶都存在于细胞质中，Galitzer和Oehme(1985)对牛所有器官的CK进行检测发现，内脏器官中含有的CK要远远少于骨骼肌和心肌，并且大部分的CK属于同功酶CK-BB。健康牛血清中的CK组成几乎全部由CK-MM构成，但研究发现在怀孕中和产后妇女、怀孕豚鼠的血清中还存在有可检测到的CK-BB(脑源或平滑肌源)和CK-MB(Clark et al.,1994)。造成以上现象的原因很有可能是在怀孕后期对能量(新陈代谢)更高的需求(Clark et al.,1994)，即子宫组织在分娩前后对其机械性和新陈代谢有更高的要求(Abramov et al.,1996)。

我们研究表明子宫内膜感染发炎后血清肌酸激酶活性显著增高，据研究结果其可作为奶牛子宫内膜炎的重要诊断指标。目前，奶牛子宫内膜炎的诊断主要依靠视诊、触诊和子宫探针为主的传统方法，存在早期诊断确诊率低和导致植入性病原菌二次感染的问题。因此，迫切需要研究建立一种适用于奶牛子宫内膜炎早期排查的快速、灵敏、经济适用、操作简便的现场快速检测方法。

免疫胶体金技术是一种应用较广的免疫学方法，该技术是一种将胶体金颗粒与包括抗原、抗体在内的许多蛋白质标记形成免疫金复合物的技术。使用免疫金标技术制备的标记物作为检测系统中的指示试剂，应用在检测传染病、环境污染物、毒品、早孕以及兽医等领域，这种技术的应用很大程度上提高了体外诊断技术的简便性和快速性。

在层析材料上发生的免疫反应，具备免疫反应的高特异性、高效率性、高亲合性的特点。具体的过程是，含有待测物的样品溶液通过纤维层析材料的毛细作用沿着层析材料上移，与固定在层析材料上的针对待测物的受体(抗原或抗体)结合发生特性性免疫反应，在些过程中抗原抗体复合物不断的被积累富集，通过酶反应标记物或直观可视标记物(如胶体金)使之显色，从而达到检测目的物质的目的。

发明内容

本发明根据奶牛子宫内膜炎与血清肌酸激酶活性的正相关性，通过重组表达牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)，制备筛选鼠源单克隆抗体，进一步利用胶体金包被和免疫层析原理研制了一种快速检测牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的试纸条，用于田间监测奶牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)的变化。

本发明的目的是提供一种牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)胶体金免疫层析快速检测试纸条及方法，由此快速即时检测子宫内膜炎，通过胶体金免疫层析定量检测的方法，检测牛血清中肌酸激酶同工酶(CK-BB)的浓度，从而用于评估奶牛子宫内膜炎情况，准确，快速，灵敏度高，无需专业人员操作，成本较低，便于推广使用。