[发明专利]一种同时检测多种真菌毒素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及真菌毒素检测的技术领域，具体涉及一种同时检测多种真菌毒素的方法。

背景技术

真菌毒素是真菌产生的次级代谢产物，目前人们已经发现400多种真菌毒素。毒性强的真菌毒素主要包括黄曲霉毒素B1(AflatoxinB1，AFB1)、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)、呕吐毒素(Deoxynivalenol，DON)、伏马毒素(fomoni-sin，FB)、T-2毒素(T-2toxin，T-2)等。多年来，一些粮食在生长和贮存中，经常被多种不同的真菌毒素污染。即使一些真菌毒素不会同时污染同一粮食作物，但食品加工通常把多种原料加工成一种食品，造成真菌毒素的累积，人们消费这些食品时可能会同时摄入多种真菌毒素，而这些毒素可能存在毒性加和效应，对人类健康的危险系数增大。

目前，实验室常用真菌毒素检测方法主要有四种:免疫亲和柱-高效液相色谱法、酶联免疫试剂盒Elisa方法和胶体金免疫层析方法，直接提取液相色谱质谱法。这几种方法各有优点，但是前三种都只能测单一种类的真菌毒素，不同种类真菌毒素的分别测定成本较高，试剂损耗大且污染严重；第四种是直接提取样品中的毒素用液相色谱质谱联用同时测定多种毒素，但是为了去除检测时样品的基质效应，此方法需要加入全碳标记的稳定同位素毒素为内标，稳定同位素内标价格昂贵，实验成本非常高。因此有必要开发一种实验成本相对较低，能够对多种真菌毒素进行同时检测的检验方法，缩短分析时间，提高检测效率，减少试剂损耗和污染，提高食品安全性。

发明内容

本发明提供了一种同时检测多种真菌毒素的方法，解决了现有的真菌毒素检测方法只能检测单一毒素的缺陷，检测成本低，提高了检测效率，减少了试剂损耗和污染，以及以全碳标记的稳定同位素作内标，液相色谱质谱联用同时测定多种毒素的检测成本过高的问题。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种同时检测多种真菌毒素的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

步骤一：样品提取

将25g样品加入到100mL提取液中，振荡离心，得到残渣和样品的上清液；向所述残渣中加入体积比为800:200的甲醇和纯水，振荡离心，取残渣的上清液；将所述样品的上清液与所述残渣的上清液混合为上清液；所述提取剂为按照体积比为800:10:190的乙腈、乙酸和纯水混合溶液；

按照体积比为10:70的比例混合所述上清液和稀释液，然后用滤纸过滤，得到提取液；所述稀释液为按照浓度比为0.8％:0.02％:0.02％:0.116％的NaCl、KCl、KH₂PO₄和Na₂HPO₄·12H₂O的混合水溶液；

步骤二：提取液净化

取所述步骤一中的提取液缓慢通过复合免疫亲和柱并排干，然后用水洗涤两次；再用体积比为2:98的乙酸和甲醇的混合液对复合免疫亲和柱进行至少两次的梯度洗脱，并收集从复合免疫亲和柱流出的洗脱液；

将所述洗脱液用氮气吹干，并用50％甲醇溶液定容，得到待测液；

步骤三：建立标准曲线

用50％甲醇溶液配制一系列包含待检测的多种真菌毒素组分的标准混合溶液，采用液相色谱质谱联用同时检测所述标准混合溶液中的真菌毒素，建立相应的标准曲线；

步骤四：检测待测液

采用液相色谱质谱联用同时检测所述步骤二中待测液中的真菌毒素的含量，根据所述步骤三中建立的标准曲线进行定量分析；依据所述步骤三中标准溶液的质谱峰面积和浓度分别绘制每种真菌毒素的标准曲线，依据所述待测液的峰面积用外标法求出所述待测液中真菌毒素的浓度，根据所述待测液中真菌毒素的浓度计算出样品中真菌毒素的含量。

进一步，所述样品中真菌毒素的含量的计算方法为：其中X为样品中真菌毒素的含量，单位为μg/kg；c为提取净化液中真菌毒素的浓度，单位为μg/L；V为加入提取液的体积，单位为mL；m为样品质量，单位为g；f为提取液稀释因子。

进一步，所述滤纸为微纤维滤纸。

进一步，所述液相色谱质谱联用同时检测标准混合溶液或者待测液中真菌毒素的含量的液相条件：流动相A:甲醇；流动相B：体积比为0.1％甲酸和1mmol/L乙酸铵的水溶液。