[发明专利]罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物监测领域，具体是罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法。

背景技术

罗非鱼(Tilapia)是一种有广泛适应性的养殖鱼类，也是联合国推荐的主要蛋白质来源的养殖鱼类。由于其具有生长快，适应广的特点，在鱼类养殖上占有重要的地位。我国是罗非鱼养殖大国，占世界出口量的90％。我国南方地区是养殖的主产区，占全国产量的90％。近年来，随着罗非鱼养殖业的产业化发展，疾病也随之而来，特别是罗非鱼无乳链球菌病的暴发，给养殖业带来严重的损失。同时也给出口带来严重的影响。

及时快速的诊断是防治罗非鱼无乳链球菌病的关键，目前对该病的主要检测诊断方法有：传统的细菌学方法、以PCR为代表的分子生物学诊断方法等，这些方法都需要特殊的检测仪器，同时需要专业的技术人员操作，操作复杂，同时耗时长，不能适应生产上的检测诊断需要。为了快速有效的控制无乳链球菌病，减少该病给罗非鱼养殖业带来的危害和损失，生产上急需快速有效简便的罗非鱼链球菌病检测诊断方法。本发明利用免疫胶体金标记技术、免疫层析技术和单克隆抗体技术，发明一种新的无乳链球菌快速诊断方法，即罗非鱼无乳链球菌的免疫层析快速检测试纸条方法，该方法具有操作简单，快速(5－10分钟内出结果)，不需要特殊的检测仪器设备，不需要专门训练的检测人员，而且可进行现场快速检测，该法尤其适合基层和临床的无乳链球菌的检测和无乳链球菌病的检疫和监测。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷和满足上述领域对于罗非鱼无乳链球菌病现场快速检测、诊断的需求，提供一种罗非鱼无乳链球菌病免疫层析快速检测试纸条及其制备方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条，选择了我们制备、筛选的抗罗非鱼无乳链球菌抗原单克隆抗体4C12作为标记垫包被的抗体，该单克隆抗体由保藏号为：CCTCC NO:C2014248，分类命名为一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株4C12，2015年1月7日保存在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学。选择抗罗非鱼无乳链球菌抗原单克隆抗体3A9为检测线(检测线(T线))包被抗体，该单克隆抗体由保藏号为:CCTCC NO:C2014244分类命名为一种产生抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体的杂交瘤细胞株3A9，2015年1月7日保存在中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学。

罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条及其制备方法，所述检测试纸条由支撑板1、样品垫2、标记垫3、包被膜4、吸水垫5组成。

将抗罗非鱼无乳链球菌单克隆抗体4C12包被至所述标记垫3上。将抗罗非鱼无乳链球菌的单克隆抗体3A9包被至所述包被膜4的检测线T线上。将羊抗小鼠免疫球蛋白抗体包被至所述包被膜4的质控线C上。

将所述样品垫2、标记垫3、包被膜4、吸水垫2依次搭接粘贴在支撑板1 上，罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条即制备完成。

上述样品垫2和标记垫3的材料是玻璃纤维膜，上述包被膜4的材料是硝酸纤维素膜，上述吸水垫5的材料是粗纤维吸水纸，所述试纸条支撑板1为不吸水的聚氯乙烯板。

上述胶体金标记的抗罗非鱼无乳链球菌单克隆抗体4C12单克隆抗体用于包被标记垫的量为每垫5μL-30μL。

上述抗罗非鱼无乳链球菌抗原的3A9单克隆抗体在检测线(T线)上的包被浓度为0.6mg/mL，包被量为每垫1-5μL/cm²；所述羊抗小鼠免疫球蛋白抗体在质控线(C)上的包被浓度为2.0mg/mL，包被量为每垫1-5μL/cm²。

具体祥细的罗非鱼无乳链球菌免疫层析快速检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1.按常规方法用上述两种杂交瘤细胞(保藏号为：CCTCC NO:C2014248：保藏号为:CCTCC NO:C2014244)分别制备小鼠腹水单克隆抗体4C12和3A9。所述抗罗非鱼无乳链球菌抗原的单克隆抗体4C12和3A9本质上为蛋白质，能特异识别罗非鱼无乳链球菌。用常用的正辛酸-饱和硫酸铵法提纯小鼠腹水单克隆抗体4C12和3A9，以BCA蛋白浓度测定试剂盒检测单克隆抗体的含量。