[发明专利]用于培养贴壁细胞的方法

说明书

本申请是国际申请日为2010年12月21日、国际申请号为PCT/FR2010/052850、进入国家阶段的申请号为201080064525.1、发明名称为“用于培养贴壁细胞的方法”的PCT申请的分案申请。

技术领域

本发明的主题是用于生产贴壁细胞的方法，根据该方法将贴壁细胞引入培养器皿内，所述培养器皿含有在培养基中的微载体，并且在这个相同器皿中执行数次连续细胞传代，每次使用先前细胞传代的所有或部分细胞群体用于执行下一次细胞传代。本发明还涉及这种方法用于生产生物学试剂特别是用于制备疫苗或药物的用途。

背景技术

在20世纪80年代，在微载体上的细胞培养技术的开发促进贴壁细胞的大规模生产和因而生物学试剂的生产。然而，旨在用于生产用于药学用途的生物学试剂的贴壁细胞的生产必须遵循特定数目的管理规定，特别是：禁止使用超过特定数目的“细胞传代”的贴壁细胞的那种，因为存在细胞的形态学和/或生物转化的危险。这特别是对于Vero系细胞的情况。

US 4,664,912描述了在用于由源于工作细胞库的细胞种子产生一批贴壁细胞的工业规模上使用的方法。它基于细胞传代的连续，其每次在不同生物反应器中发生，所述生物反应器的工作体积经过连续细胞传代的方法增加。这使得每次能够增加微载体的量，同时维持培养基中微载体的最佳浓度，这一般在1 - 5 g/l之间。细胞生物量因此经过连续细胞传代的方法增加，直至获得细胞的所需工业分批。在已借助于用胰蛋白酶处理使贴壁细胞从微载体中脱离，且随后通过将血清蛋白质或血清引入培养基内封闭酶的作用，进行细胞从一个生物反应器到另一个生物反应器的转移，以便保存尽可能多的细胞完整性。随后将获得的细胞悬液转移（在使用的微载体的存在或不存在下）到更大的生物反应器内，其含有更大量的新微载体。然而，贴壁细胞的工业生产的这种方法需要大量材料的使用和处理，其对生物学试剂的生产成本具有作用。

为了减少关于用于生产生物学试剂的贴壁细胞的生产成本，EP 1060241提出了更快速的生产方法，其不再需要从来自工作库的细胞种子再次起始，每次需要产生细胞的工业分批。该方法由下述组成：在每次细胞传代后，将大多数细胞（80 - 90%的细胞生物量）转移至一个或多个其他生物反应器中，以便继续细胞生物量的扩增且构成细胞的工业生产分批，同时维持剩余10 – 20%的细胞，以便保持“饲养细胞”原种，由其可以生产细胞的新的分批。然而，这种方法具有下述缺点：

-生产的细胞分批显示特定异质性，在它们并非全部具有相同数目的细胞传代的范围来说；

-在每次转移操作时在培养中的“饲养”细胞原种的维持不可避免地导致细胞的“衰老”，这与执行的细胞传代数目直接关联，并且因此由于已提及的规定原因仅可以在有限时间段使用。

为了免除蛋白水解酶，例如对于细胞的完整性有害的胰蛋白酶，Ohlson等人在Cytotechnology（1994），第14卷，第67-80中，描述了用于在不存在任何酶促处理的情况下贴壁细胞从微载体至微载体转移（珠至珠转移）的技术。在由贴壁细胞覆盖的微载体和裸露微载体之间的紧密接触促进细胞转移到裸露微载体上，由其可以扩增细胞。为了增加细胞生长，裸露微载体因此加入培养基中，所述培养基含有由贴壁细胞覆盖的微载体，并且进行培养基的间歇搅拌，以便促进微载体之间的接触。然而，生产的细胞群体是“失去同步性”，因为细胞处于细胞周期的不同阶段，这对于生产生物学试剂可以是重大缺点。

仍存在最佳化贴壁细胞的大规模生产以及由其衍生的生物学试剂生产的方法的需要，以便减少生产成本。

发明内容

为此，本发明的主题是：

用于生产贴壁细胞的方法，根据该方法：

a. 将贴壁细胞引入培养器皿内，所述培养器皿含有在培养基中的微载体：

b. 通过在这个相同培养器皿中执行数次连续细胞传代来扩增细胞，其中执行在第一次细胞传代后的每次细胞传代：

i. 在已对细胞群体实施酶促处理以便使细胞从微载体中脱离后，使用在先前细胞传代期间获得的所有或部分细胞群体；和

ii. 通过引入培养基和增加量的微载体；和

c. 在已对所述细胞群体任选实施酶促处理以便使细胞从微载体中脱离后，收获在末次细胞传代期间生产的细胞群体。

本发明的目的还是：

用于生产由贴壁细胞生产的生物学试剂的方法，根据该方法：

a. 将贴壁细胞引入培养器皿内，所述培养器皿含有在培养基中的微载体：