[发明专利]一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一步式免标记荧光检测汞离子的方法，属于荧光检测技术领域。

背景技术

重金属污染已成为一个重要的全球性问题，人类由于接触污染的天然水和饮用水，尤其是剧毒的重金属汞，严重威胁着人类的健康。无机汞，即Hg和Hg²⁺通过人为原因或者自然原因被释放到环境中。汞的工业来源包括煤炭和黄金开采、垃圾焚烧、木材制浆、化石燃料燃烧和化学制造等。人类更多的暴露途径包括家庭和工作场所、宗教活动、牙科用汞齐合金等。此外，Hg²⁺很难被生物降解，可通过生物放大作用在体内富集，这将引起不同的人类疾病，如肾功能衰竭，产前脑损伤，认知和运动障碍，视力和听力损失，甚至死亡。它同时也是一种神经毒素，并可导致免疫系统功能障碍。

基于Hg²⁺对人类健康的严重危害以及可持续发展的要求，建立一种快速、低成本、高灵敏、高特异性检测Hg²⁺的方法非常有必要。传统的定量检测水样中Hg²⁺的方法包括电感耦合等离子体质谱法、原子荧光光谱法(atomic fluorescence spectroscopy,AFS)、原子吸收光谱法、荧光分光光度法和X射线吸收光谱法等。然而，这些传统的方法往往需要精密仪器，复杂样品前处理、较大的样本量以及对操作的专业培训，这都限制了其广泛应用。因此，建立一种新型的高灵敏、高特异性、低成本、快速简便的适用于自然环境和生物环境中Hg²⁺检测的方法尤为重要。

SYBR Green I(SG I)作为一种荧光染料，在分析和诊断领域发挥着越来越重要的作用。自推出以来，SG I已经被有效地应用于凝胶中核酸的检测，荧光成像技术，实时定量聚合酶链反应以及生物芯片领域等。它更倾向于与双链DNA(dsDNA)结合，发出较强的荧光信号；而与单链DNA(ssDNA)相互作用较弱，只发出微弱的荧光信号。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种一步式免标记荧光快速检测汞离子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

(1)在6-8支离心管中加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再分别加入50μL浓度呈梯度的选自5-1000nM的6-8个Hg²⁺水溶液，混匀，室温下孵育0.5-3min；

(2)采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下分别对步骤(1)获得的液体进行扫描，获得各自的荧光强度值，制备荧光强度响应标准曲线；

(3)重新取3-5支离心管，加入200μL 100nM汞特异性ssDNA溶液和2μL 100×用水稀释的SYBR Green I荧光染料，再加入经0.45μm微孔滤膜过滤的50μL待测水样，混匀，室温下孵育0.5-3min；采用荧光分光光度计，以490nm为激发波长，在535nm的发射波长下对待测水样进行扫描，获得荧光强度值，与荧光强度响应标准曲线比对，得到待测水样的Hg²⁺浓度，所述ssDNA的核苷酸序列用SEQ ID NO.1所示；所述ssDNA溶液的溶剂的配方为：4-羟乙基哌嗪乙磺酸:10mM,NaNO₃:20mM,pH:7.6，余量为水。

本发明的优点：

本发明的方法灵敏、便捷、快速、经济，满足现场快速检测的要求。

附图说明

图1为汞特异性ssDNA序列二级结构。

图2为T-Hg²⁺-T结构示意图，其中T为胸腺嘧啶。

图3为实验原理图。

图4为不同浓度Hg²⁺的荧光响应曲线。

图5为检测体系的荧光强度响应标准曲线。

图6为检测体系的特异度验证。

阳性对照组(虚线框):黑色柱:1μM Hg²⁺；浅色柱:300nM Hg²⁺。

实验组:黑色柱:1μM干扰离子；浅色柱:900nM干扰离子与300nM Hg²⁺混合物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。