[发明专利]一种端粒酶启动基因表达方法及其应用

权利要求书

1.一种端粒酶启动基因表达方法在制备杀灭肿瘤细胞的药物中的应用，所述端粒酶启动基因表达方法，包括如下步骤：

（1）将含有端粒酶识别序列的核酸分子与载体序列相连，构建出携带有端粒酶识别序列的效应基因表达载体并导入具有端粒酶活性的细胞，端粒酶在具有端粒酶活性的细胞内结合并延长该效应基因表达载体，在其末端合成的端粒重复序列；所述核酸分子带有位于其末端的粘性末端序列或带有由核酸酶切割后产生的粘性末端序列，所述粘性末端序列含有一段3ʹ突出的单链序列，所述3ʹ突出的单链序列含有端粒酶识别序列；所述载体序列携带有一种或多种基因序列及基因表达所需元件，所述基因为其表达产物对细胞生理可产生影响，或致细胞死亡的基因；

（2）同时向具有端粒酶活性的细胞导入可识别结合经步骤（1）合成的末端端粒重复序列的基因表达激活系统；所述基因表达激活系统为基因转录激活分子或复合物；

（3）基因表达激活系统识别并结合端粒重复序列，激活效应基因表达载体上效应基因的表达。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述端粒酶识别序列为5ʹ-TGTT-3ʹ、5ʹ-AGTT-3ʹ或其他可被端粒酶识别的序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述核酸酶为直接转入细胞中的酵母同宗接合切换内切酶HO酶或转入细胞中的HO酶表达载体表达的HO酶。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（1）所述基因表达所需元件包括各种来源的最小启动子序列、Kozack序列或polyA序列。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述基因为Cas9、Tn5、核酸内切酶、颗粒酶或凋亡酶基因。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因转录激活分子或复合物，包括锌指蛋白、转录激活物样效应物、CRISPR/Cas9或端粒DNA结合蛋白。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9包括可靶向结合端粒重复序列的引导RNA和无核酸酶活性的Cas9；所述无核酸酶活性的Cas9为dCas9。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述引导RNA包括单分子引导RNA和双分子引导RNA。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因转录激活分子或复合物，包括可实现基因转录激活功能的SunTag系统、SAM系统、脚手架RNA系统。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因转录激活分子或复合物，包括直接导入细胞的基因转录激活分子或复合物，以及基因转录激活分子或复合物的基因表达载体。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤（3）所述效应基因的表达，其表达产物为RNA或蛋白质。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述RNA为可引起细胞生理发生改变的RNA。

13.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为可引起细胞生理发生改变的蛋白质或多肽，包括Cas9蛋白、Tn5蛋白、核酸内切酶、颗粒酶或凋亡酶；所述Cas9蛋白与引导RNA结合，靶向结合并切割细胞的端粒DNA序列或其他DNA序列，引发细胞生长抑制或死亡；所述Tn5蛋白与转入细胞的含有ME序列的DNA结合，非靶向性切割细胞DNA，引发生长抑制或细胞死亡；所述核酸内切酶特异性或非特异性切割细胞DNA，引发细胞生长抑制或死亡；所述颗粒酶及凋亡酶可引发细胞凋亡。