[发明专利]新的EGF-A和B的组合突变体制备及其在生物药物中的应用

说明书

本发明提供了新的人LDL受体EGF(AB)突变体，以及突变体与人免疫球蛋白Fc片段融合的制备方法。本发明的EGF(AB)突变体比EGF‑A突变体具有更好的生物学活性；融合Fc片段的EGF(AB)突变体比EGF(AB)突变体具有更长的半衰期，可用于治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化等心血管疾病以及通过降低血浆PCSK9水平而受益的其它疾病。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及低密度脂蛋白受体(low-density lipoproteinreceptor,LDLR)胞外域表皮生长因子前体同源域A和B(Epidermal growth factorprecursor homology domain A and B,EGF-AB)的突变体及其融合蛋白，制备方法和治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化等心血管疾病以及通过降低血浆PCSK9水平而受益的其它疾病的应用。

背景技术

LDL受体是一种跨膜细胞表面糖蛋白，包含5个功能结构域：配体结合域、表皮生长因子前体同源域、O-连接糖域、跨膜域和胞浆域。LDLR的配体结合域与表皮生长因子前体同源域均位于胞外，前者可与载脂蛋白ApoB、载脂蛋白ApoE、低密度脂蛋白(LDL)和β极低密度脂蛋白(β-VLDL)结合，并形成配体与受体的复合体内吞入胞，因而在胆固醇代谢过程中起了关键作用。表皮生长因子前体同源域因与表皮生长因子(epithelial growth factor,EGF)前体胞外域有33-35％的结构同源性而得名，其EGF-A区与前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9,PCSK9)的催化活性有关，PCSK9通过其催化结构域与EGF-A结合，并导致LDLR降解或降低其摄取LDL的能力。而EGF-B区具有钙结合特性，有助于功能域之间的稳定。至今，全球范围内已近700余种LDLR的缺陷类型与家族性高胆固醇血症(FH)发生相关，其中10％的缺陷为LDLR的EGF-A或EGF-B发生的缺陷(http://www.ucl.ac.uk/fh)。EGF-A是影响PCSK9催化活性的重要片段，体外功能研究发现，对EGF-A区的位点突变，可使其结合PCSK9的能力减弱或增强，如对EGF-A的Leu³¹⁸实施不同电荷的氨基酸置换，与野生型EGF-A相比，只有精氨酸置换显著增强EGF-A突变体与PCSK9的结合能力(Gu等，Journal of Lipid Research.2013；54:3345-3357)；EGF-A区Cys³⁰⁸的突变(C308Y)是中国和波兰的高胆固醇血症患者中的突变类型(Zhang等，J Lipid Res.2003 Oct；44(10):1850-8；-Miarka等,Mol Biol Rep.2012 May；39(5):5181-6.)，其具有结合PCSK9的能力。中国专利公开了C308Y与其它突变位点的串联形式，以及在制备治疗高胆固醇血症中的用途。但我们最近发现，EGF-A区Cys³⁰⁸的另一突变类型(C308T)也有显著结合PCSK9的能力；我们进一步还发现，EGF-B或EGF-B突变体可显著增强包含(C308T)或其它突变位点的EGF-A突变体结合PCSK9的能力，抑制PCSK9介导的LDLR降解，恢复肝细胞表面LDLR对LDL的摄取能力；而且EGF-AB突变体明显优于野生型EGF-AB。

发明内容

本发明的目的是提供新的EGF(AB)突变体及其与Fc的可溶性融合蛋白，所提供的突变体是在LDL受体胞外域的第295位天冬酰胺(Asn)由丝氨酸(Ser)取代(或置换)、第308位半胱胺酸(Cys)由苏氨酸(Thr)取代(或置换)、第318位亮氨酸(Leu)由精氨酸(Arg)取代(或置换)、第334位异亮氨酸(Ile)由缬氨酸(Val)取代(或置换)、第346位亮氨酸(Leu)由组氨酸(His)取代(或置换)的任意一位以上氨基酸发生取代(或置换)的EGF-AB片段。