[发明专利]一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒

说明书

本发明提供了一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒，所述试剂盒包括：用于增强染色效果的染色增强液和带荧光染色标记的特异性抗体；其中所述特异性抗体包括：CK20抗体、CD45抗体和CDX2抗体；所述染色增强液包括浓度为0.001～1mg/mL的表面活性剂。本发明的试剂盒，可以有效的富集目标细胞，并且确认富集的目标细胞是否来源于结直肠癌的早期患者。同时，本发明通过双瘤标检测增加肿瘤检测灵敏度并且进一步通过CEP8的检测保证检测的准确性。此外，本发明通过染色增强液加强染色效果，使多种带荧光染色标记的抗体都可以与目标细胞结合，对目标细胞染色，染色效果更好，荧光更强，而且边界清晰。

技术领域

本发明涉及液体活检领域，具体地说是一种基于液体活检的结直肠癌检测的试剂盒。

背景技术

结直肠癌(CRC)一种常见的癌症，其发病率和死亡率在世界范围内所有癌症中均位居第三，平均每年有120万人被诊断为CRC患者。据统计，我国CRC的发病率和死亡率均高于世界平均水平，2011年平均每十万人口就有平均23名被诊断为CRC患者，且每十万人中约11名死于CRC。而且近些年我国CRC的发病率和死亡率呈持续增长的趋势。所以，对于CRC的早期筛查以及疾病发展过程中的检测就显得尤为重要。在这一方面，基于循环肿瘤细胞(CTC)检测的方法具有众多传统检测方法所没有的优势，包括无创、快捷和适用于早期筛查等。

CTC是指自发或因诊疗操作由实体瘤原发灶或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。由于转移是癌症相关死亡的主要原因，而CTC作为肿瘤转移的种子，在新的肿瘤生物标志物的发现、肿瘤预后判断及个体化治疗等方面都存在很大的应用潜力，是国内外肿瘤研究的热点之一。到目前为止，有众多研究关注于CRC的CTC富集和检测，这些研究通常通过比较分析CRC患者中CTC的数量与患者预后及生存的关系，甚至与患者病理分期相关，主要集中于中晚期CRC患者或直接研究转移性CRC患者，而针对于早期CRC的筛查缺乏研究。

到目前为止，虽然基于EpCAM的CTC捕获、富集分析平台仍然被作为一些肿瘤中CTC检测的金标准，但研究显示，该方法对于晚期CRC和非转移性的CRC的检出率通常很低，而且以EpCAM为生物标志物对于发生EMT的CTC的检测仍存在很高的假阴性。此外，EpCAM这一广谱的上皮生物标志物不仅不适合用于肿瘤早期的检测，而且也不具有组织特异性，无法追溯CTC的具体组织来源，而这一点对于后续的肿瘤治疗具有重要意义。因此，发现并应用一些CRC组织特异性的生物标志物进行CTC的早期筛查及检测分析显得尤为重要。

研究显示，大约53～78％的CRC患者CTC中表现为角蛋白20阳性(CK20+)，CK20作为角蛋白家族中的一员已被很多研究用作CRC患者CTC检测的生物标志物，不仅是因为其较高的阳性率，更主要是因为它具有良好的组织特异性，除在胃癌和胰腺癌中有少量表达外，其在CRC组织中呈现出71-100％的高表达。因此，基于CK20的CTC的检测不仅具有较高的阳性检出率，而且还具有较高的组织特异性定位的能力。此外，尾型同源盒转录因子2(CDX2)也是一种重要的CRC来源的CTC检测标志物，在CRC的CTC检测研究中，CDX2的阳性检测率可以达到80％多，其在CRC组织中也呈现出76-100％的高表达。与此同时，CDX2还具有比CK20更高的结直肠组织特异性，适用于CTC早期检测中的组织溯源。

据此，虽然CK20或CDX2对于CRC来源的CTC的检测率比较高，但是单独使用CK20或CDX2作为CTC检测的标志物都会存在一定程度阴性率，造成漏检。所以，联合CK20和CDX2作为CTC早期筛查的生物标志物，不仅可以将检测的灵敏度最大化，而且还可以据此判定早期筛查样品中CTC的具体组织来源。

公告日为2014年1月15日，公告号为CN102313813B的中国专利中公开了一种通过免疫荧光染色对稀有细胞进行检测的方法，该方法对白细胞、稀有细胞和细胞核进行三色染色，再通过荧光检测。但是该方法仅能通过一种单抗来特异性识别该稀有细胞，容易造成漏检。同时，由于细胞的异质性，每个细胞表达的抗原量不一，导致有时荧光强度非常微弱，在荧光显微镜下难以分辨。