[发明专利]一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法

说明书

本发明公开了一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：A.叶片组织加入CIB缓冲液，研磨后依次通过70μm、35μm和15μm滤网过滤，过滤液200×g离心5min，去除组织残渣、细胞碎片；B.将上述滤液1000×g离心10min，收集富含叶绿体的沉淀；C.收集步骤B离心后的上清液，5μm滤网过滤，过滤液经2000×g离心10min，弃沉淀，上清液17000×g离心10min，收集富含线粒体沉淀；D.上述沉淀分别用洗涤缓冲液洗涤，并用DNase I消化以去除背景基因组的污染；E.叶绿体沉淀1000×g离心10 min后弃上清，线粒体沉淀17000×g离心10 min后弃上清，沉淀用洗涤缓冲液洗涤。

技术领域

本发明属于细胞生物学和分子生物学技术领域，具体涉及一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法。

背景技术

叶绿体(chloroplast)和线粒体(mitochondrion)的研究在系统进化、物种鉴定、核质互作、基因工程等领域具有举足轻重的作用。分离高纯度的叶绿体和线粒体细胞器是开展相关研究的关键。密度梯度离心是目前分离这两种细胞器最为常用的方法，它是用一定的介质在离心管内形成连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆或混悬液至于介质的顶部，通过重心或离心场力的作用使细胞分层和分离。密度梯度离心介质包括蔗糖(Sucrose)、血清白蛋白(Serum albumin,ALB)、聚蔗糖(Ficoll)、氯化铯(CsCl)和Percoll等。密度梯度离心方法存在一些不足：1)血清白蛋白、聚蔗糖、氯化铯和Percoll等介质的价格昂贵；2)价格相对低廉的蔗糖在高浓度时又会对线粒体和叶绿体活性造成不利影响，特别是线粒体对介质的渗透压十分敏感，高浓度会导致其变形或破裂；3)配置惰性梯度介质溶液步骤繁琐且耗时；4)配置的分离液无法重复使用；5)离心时间较长；6)操作严格，不易掌握。尽管商业化的试剂盒(如Invent biotechnologies公司开发的Minute^TM ChloroplastIsolation Kit、SIGMA公司开发的Chloroplast Isolation Kit和ThermoFisher公司研发的Mitochondria Isolation Kit for Cultured Cells)操作简便，分离效果可靠，但其价格昂贵，使用次数有限无法大批量使用，且不能同时分离两种细胞器。

实际上，植物的叶绿体、线粒体以及叶肉细胞在形态、大小存在较大的差异。高等植物叶绿体呈双凸或平凸透镜状，长径5-10μm，短径2-4μm，厚2-3μm；线粒体是一些大小不一的球状、棒状或细丝状颗粒，一般为0.5-1.0μm，长1-2μm；叶肉细胞的大小为30-50μm。此外它们在沉降系数上也存在差异，因此利用物理分筛和差速离心从叶片匀浆中同步分离高纯度的叶绿体和线粒体理论上是可的。

具有活性的完整叶绿体在488nm激发光和650～750nm吸收光下产生红色自发荧光；而线粒体可借助于线粒体特异染料(Red CMXRos)染色，在激发光和吸收光分别为579nm和599nm条件下观察染料荧光。因此，利用荧光显微技术(fluorescencemicroscopy)可有效地跟踪检测叶绿体和线粒体细胞器，提供了可视化鉴定分离的叶绿体和线粒体纯度的方法。

发明内容

本发明的目的是在于提供一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，材料易得，方法简单，该方法可广泛应用于各种植物叶绿体和线粒体细胞器的同步分离以及高纯度叶绿体和线粒体基因组提取。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种同步分离高纯度植物叶绿体和线粒体的方法，其步骤是：

1、植物叶片组织冲洗干净并剪碎，按照1:15(m:v)加入CIB缓冲液，研磨后依次通过70μm、35μm和15μm滤网过滤，过滤液200×g离心5min，去除组织残渣、细胞碎片；

2、根据叶绿体和线粒体不同的沉降系数，将步骤1获得的滤液1000×g离心10min，收集富含叶绿体的沉淀，