[发明专利]受激辐射损耗显微装置

说明书

本发明提供的受激辐射损耗显微方法及装置，包括如下步骤：步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的STED光；步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量，使荧光样品发出荧光；步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。本发明提供受激辐射损耗显微方法及显微装置，分辨率高，能够连续调节激发光和STED光的波长，适应不同的荧光。

技术领域

本发明涉及显微成像，特别涉及一种受激辐射损耗显微方法及显微装置。

背景技术

光学显微镜在生物学领域起着举足轻重的作用，但是由于光的衍射效应，光学成像系统都有一个分辨率极限。1873年,德国物理学家Ernst Abbe提出远场光学显微镜的横向分辨率极限的数值约为λ/2NA,其中λ是光波波长,NA 为透镜数值孔径且小于1，因此在可见光波段内，远场光学显微镜分辨率极限仅有200纳米。由于细胞的细微结构，调节细胞增殖﹑分化﹑凋亡以及信号传递等体系的特征尺度都在纳米量级，所以光学显微镜分辨率的提高就成为一个亟需解决的难题。美国专利公开的专利号为US5731588的受激辐射损耗显微镜 (STED)是第一个突破衍射限制的超分辨显微镜，在2006年被Science杂志评选为科学界十大突破之一，其基本原理是使用两束激光，第一束脉冲激发光将荧光材料从基态S₀激发到第一单重激发态较高振动能级S₁^*，电子会快速弛豫到激发态最低振动能级S₁，与此同时，使用另一束波长较长的激光(通常位于发光材料发射光谱的红外末端)，称为退激光或STED光，将处于S₁态的电子以受激发射损耗方式退激发至基态，并发出一个与STED光波长相同的光子。由于STED光是经过相位调制的中心为零点的甜面包圈形状光斑，因此STED 光中心没有退激发效果，通过重叠激发光与退激发光斑，只允许位于STED零点的激发光激发的荧光物质发光，从而提高分辨率。目前，受激发射损耗显微镜应用于生物医学领域所达到的分辨率约为50纳米。

通常，受激辐射损耗显微镜的激发光源需要使用皮秒脉冲激光，而STED 光则可选用高能量的脉冲激光或连续激光光源。但是，由于各种发光材料的吸收及发射波长差别很大，因此为了能适用于尽可能多的发光材料，理想的受激发射损耗显微镜需要能连续调节激发光和STED光的波长。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供一种高分辨率的受激辐射损耗显微方法及显微装置，能够连续调节STED光的波长。

第一方面，本发明提供的受激辐射损耗显微方法，包括如下步骤：

步骤S1，将初始激光光束分为第一激光光束和第二激光光束；

步骤S2，调节所述第一激光光束的能量，并将所述第一激光光速聚焦在晶体光纤上，所述晶体光纤能够被激光激发,输出具有连续光谱的激发光；

步骤S3，调制所述激发光为红色光斑，调制所述第二激光光束为环形的 STED光；

步骤S4，将所述激发光和所述STED光重叠为同轴光线，并聚焦于荧光样品上；

步骤S5,通过调节所述第一激光光束的能量，使荧光样品发出荧光；

步骤S6，采集荧光样品发出的荧光，获得图像。

进一步地，步骤S1中，所述初始激光光束通过飞秒激光器获得；并使所述初始激光光束透过偏振分光棱镜，从而获得相互垂直的所述第一激光光束和所述第二激光光束。