[发明专利]CPS1报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域中的重组细胞系，特别是涉及一种氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)-报告基因人肝细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

在所有参与药物生物转化的器官中，肝脏是最主要的场所。药物在肝脏的代谢是药物消除的一种主要方式。由于药物在肝脏的代谢直接与其药理活性和毒性特征相关，进而影响药物在临床上的安全性和有效性。因此，药物在肝脏的代谢是临床前新药研发过程中的一个非常重要的环节。采用合理、有效的模型预测药物作用及潜在的毒性对药物代谢的评价至关重要。相对于整体模型来说，体外研究模型以其快速、准确、高通量的优势在药物的肝脏生物转化研究中被药物研发的科学工作者广泛使用，然而在这些模型中，肝细胞性状及相关代谢功能的维持对获得相对准确的药物代谢评价尤为重要。

毋庸置疑，来源于正常组织的原代肝细胞和组织切片，具有I、II相代谢酶活性，是进行临床前药物代谢研究最为理想的体外平台。然而，由于受到来源、细胞分离及培养方法各异、细胞活性差异巨大等因素的限制，原代培养人肝细胞并不能满足大规模的药物安全性筛选需要。此外，体外培养的肝细胞迅速丢失大部分生物学活性，常规培养3天以上的肝细胞通常已不能作为药物评价的模型。为了改善其生物学活性，人们正在开发多种肝细胞培养方法，包括与肝基质细胞共培养、三明治培养、组织化培养等，已被证实可不同程度地提高肝细胞的活性和存活时间。

目前，可从肝脏干/祖细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞、多种成体干/祖细胞诱导分化以及通过谱系重编程从体细胞获得肝样细胞，这也成为体外肝细胞的重要来源。人的胚胎干细胞(hESCs)是从早期胚胎中发现、能在体外培养的一种高度未分化细胞，具有胚胎发育的全能性即具有向3个胚层的组织和细胞分化的特性，在特定条件下可被诱导分化为肝细胞。如何将hESCs向肝细胞诱导分化，并获得具有成熟肝细胞功能的细胞是近年来干细胞研究领域关注的重点。通过序贯加入不同细胞因子和/或小分子组合，不同种属的胚胎干细胞在体外可成功被诱导分化为与成熟肝细胞类似的肝细胞样细胞(Baharvand et al.Int J Dev Biol.2006，50(7):645-652；Cai et al.Hepatol.2007，45(5):1229-1239；Hay et al.Stem Cells.2008，26(4):894-902.)，而人诱导多能性干细胞也可以被相似的方法诱导分化为肝细胞样细胞(Si-Tayeb et al.Hepatology.2010，51(1):297-305；Sullivan et al.Hepatology.2010，51(1):329-335.)。尽管不同的研究团队使用不同的细胞因子和/或小分子组合，不同方案相同的地方都在于采用多步法。因而在各阶段特别是早期阶段，细胞分化方向发生的偏离都会在后续各阶段逐渐累积，并剧烈放大，从而造成诱导效率低下，诱导获得的细胞呈现异质化。这种异质化在干细胞肝向诱导分化中表现为：最终获得的细胞，不仅包括成熟肝细胞，同时也包括肝祖细胞、肝干细胞以及其它中间态细胞。由于中间态细胞不具备肝细胞特有的功能或是肝细胞功能低下，从而使得诱导获得的细胞整体功能低下，在药物代谢评价上存在重大缺陷。

与此同时，目前在药物评价中常选用终点型的指标(如细胞存活率)，从而使得药物作用过程监测变得复杂，需要增加更多设置以获得相对准确的结果。因此，建立简易直观、可进行实时观测的具有原代肝细胞特性的评价平台将大大促进药物代谢评价。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种氨甲酰基磷酸合成酶1(CPS1)报告基因人肝细胞系的构建方法。

本发明所提供的CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1)构建携带靶向CPS1基因的单一向导RNA(sgRNA)编码序列的骨架载体，简称sgCPS1；

2)构建CPS1基因的打靶载体，简称CPSLR-2A-tdTomato；

3)将sgCPS1和CPSLR-2A-tdtomato转染到人肝细胞系中，经筛选获得稳定的tdTomato标记CPS1的CPS1-tdTomato报告人肝细胞系。

在上述CPS1报告基因人肝细胞系的构建方法中，所述步骤1)中用于构建携带CPS1基因的单链向导RNA(sgRNA)骨架载体的工具载体包括px458、px330、px461和px333，优选为pX458。以工具载体pX458为出发载体构建携带CPS1基因的单一向导RNA(sgRNA)的骨架载体(命名为pX458-sgCPS1)的方法，包括以下步骤：