[发明专利]快速区别一年生黑麦草和多年生黑麦草种子的鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速区别一年生黑麦草和多年生黑麦草种子的鉴定方法。具体涉及一年生黑麦草和多年生黑麦草种子萌发后幼根在紫外线照射下不同的荧光反应及其检测方法。

背景技术

一年生黑麦草(Lolium multiflorum)和多年生黑麦草(L.perenne)生长速度快，产草量高，是青饲、调制干草、放牧或混播的优质禾本科牧草，亦是用于城市绿化的重要草坪草，因而在我国有着广泛的种植范围和种植面积。然而这两种黑麦草种子在外观形态上非常相似(图1)，给种子的纯度鉴定带来很大困扰，是黑麦草类种子质量检验中的一大难题。生产中一旦混杂，将对其种植和利用产生不可挽回的损失。因而，快速、准确区分一年生黑麦草和多年生黑麦草种子，对于提高我国黑麦草类种子的利用具有十分重要的意义。

前人对一年生黑麦草和多年生黑麦草种子的鉴定技术研究可归纳为四类：

一是形态鉴定。即根据种子的大小、颜色、形状、芒以及内外稃的脉纹、质地、长度等形态学特征进行区分。但是由于两种黑麦草种子的形状、大小和颜色十分相似，特别是在成熟度不一致以及环境、气候等因素的影响下，形态特征基本无规律可循，加之清选、去芒等现代加工技术的应用，更是削弱了它们固有的特征，致使鉴定工作难度极大，鉴定结果存在一定的主观性。

二是申请号为201410023022X，名称为“鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒及其方法”的中国专利。公开了一种鉴定多年生黑麦草种子真伪的特异分子标记试剂盒的方法，该方法提供了两种黑麦草种子的特异分子标记引物、试剂盒以及标记方法。但是在鉴定中需要分子专业技术人员，以及PCR仪、电泳仪和化学发光凝胶成像系统等大型昂贵的仪器设备，因而限制了其推广应用。

三是田间鉴定。即将种子播种于试验田，待出苗后开始观察、鉴定，试验持续整个生育期。该方法成本高、周期长、效率低，无法满足生产和市场需要。

四是荧光反应鉴别试验(阎旭东，1999)。将25粒种子在20cm x30cm的滤纸上摆放成一行卷成筒状，置于20℃-30℃变温培养箱中，黑暗条件下持续培养18d，发芽后的种子置于波长3600-3700埃的紫外线检测器下用紫外光线照射，根据胚根的荧光强度进行评定。该试验每个黑麦草种参试种质仅为2个，缺乏代表性；发芽率偏低，影响鉴别结果的准确性；发芽持续18d，未达到快速鉴定的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速区别一年生黑麦草和多年生黑麦草种子的鉴定方法，以解决现有特异分子标记技术需要专业技术人员和大型仪器设备，以及荧光反应鉴别试验未达到快速鉴定的不足。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速区别一年生黑麦草和多年生黑麦草种子的鉴定方法，其主要特点包括如下步骤：

(1)发芽床：在培养皿中铺设双层滤纸作为发芽床；

(2)破除休眠种子预处理：用0.15-0.25％KNO₃溶液代替水润湿发芽床以破除休眠种子；

(3)置床：将净种子摆放在用0.15-0.25％KNO₃溶液润湿的发芽床上；

(4)培养：将培养皿置于培养箱内，在不超过250lux的弱光条件下保持29℃～31℃恒温持续培养7d～8d，即幼根发育至根迹产生的荧光明显能被检出时，将培养皿移至暗室；

(5)鉴定：在300nm～400nm辐射波长的紫外光下观察培养皿内种子幼根对紫外线照射产生的不同反应；一年生黑麦草种子的幼根在紫外线照射下显现荧光，多年生黑麦草种子的幼根在紫外线照射下不显现荧光。

本发明的有益效果，可快速有效的鉴定出一年生黑麦草和多年生黑麦草种子。此方法具有准确性高、稳定性强、简单快捷、易于推广等特点，能够对黑麦草类种子进行批量检测，为准确区分黑麦草类种子提供可靠的技术支持。本发明处理方法简单、快捷、成本低、易操作、准确度高，稳定性好，在实验室条件下短时间内即可完成，易于推广应用。本研究采用的40份黑麦草类种质(表1和表3)分别来自北京、四川、云南、甘肃、宁夏等5个省区的14个公司，以及国家草种质资源库，基本覆盖了目前我国市场上流通的黑麦草类草种，因而具有很强的代表性和推广价值。本发明有助于种子检测中心(站)，种子生产、经营企业实验室，以及基层种子管理站、草原站、农技站工作人员对两种黑麦草种子的区分，在黑麦草产业化中具有广阔的应用前景和显著的经济效应，对保证农产品质量安全，维护生态环境建设，促进畜牧业生产发展具有重要意义。

附图说明