[发明专利]一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用。

背景技术

动植物和微生物中含有糖醛酸的糖分子种类较多，如动物体内的糖胺聚糖(肝素、乙酰肝素、硫酸软骨素ABCDE、硫酸角质素等)、陆生植物中的果胶、海洋藻类中的褐藻胶、褐藻糖胶及其低聚物和衍生物等，这些酸性多糖具有多种生物学活性。如肝素和低分子肝素具有抗凝和抗血栓活性，硫酸软骨素具有抗神经炎和降血脂活性，柑橘果胶具有抑制肿瘤转移的功能，以褐藻胶为原料开发的海洋糖类药物藻酸双酯钠、甘糖酯等具有抗脑血栓、脑缺血及高血压、高脂血症、冠心病、心绞痛等疾病。以岩藻聚糖硫酸酯为原料开发的海昆肾喜胶囊具有抗慢性肾功能衰竭症等，这些糖药物分子中均含有丰富的羧基。然而糖类化合物尤其是多糖由于结构复杂，没有特定的紫外吸收光谱，使得微量检测困难，进而限制了其体内药代动力学研究并成为糖药物开发的瓶颈。传统的糖类药物代谢动力学研究方法有同位素标记法、免疫学法、色谱分析法等，由于过程繁琐，灵敏度低，结果重复性差而受到限制。

荧光标记及活体成像检测技术由于灵敏度高，检测结果直观，已广泛用于生命科学研究及药物开发中。研究表明，Cy7可对姜黄素进行荧光标记，并利用活体成像技术对姜黄素在小鼠体内分布情况进行实时检测，表明该技术可对姜黄素在小鼠体内代谢进行研究(孙永等，南京中医药大学学报，2011，27(6):539-541)。但是，对于糖类化合物特别是含有糖醛酸的糖分子是否能采用类似技术进行荧光标记，并研究其在活体内的药代动力学特点及组织和器官分布尚无专利或文献报道。

发明内容

针对含糖醛酸类糖分子体内代谢和组织器官分布研究方法不灵敏的问题，本发明提供了一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子及其制备方法和应用，本发明能弥补现有技术存在的不足之处。本发明所提供的荧光标记及纯化方法简单，效率高，荧光信号强，检测灵敏度高，结果重现性和可视性好，尤其是对于未知结构的糖分子药代动力学研究具有明显的优势。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了一种荧光标记的含糖醛酸的糖分子，所述荧光标记的含糖醛酸的糖分子经过如下标记过程获得：

其中，所述R为含有羧基的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述荧光分子为具有氨基的花青染料Cy3、Cy5和Cy7中的至少一种。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子的制备方法，它包括以下步骤：(1)羧基活化：将含糖醛酸的糖分子溶解在2-吗啉乙烷磺酸缓冲液中，再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，混合均匀形成反应体系，搅拌反应，反应结束后用透析袋透析或凝胶色谱柱纯化，透析液或糖分子洗脱组分减压浓缩后冷冻干燥得活化的糖分子；

(2)荧光标记：将步骤(1)活化的糖分子溶解在磷酸盐缓冲液中，加入含有-NH₂的荧光分子，形成总反应溶液，搅拌反应2～24h，浓缩，将浓缩液转移至透析袋中透析脱盐，透析内液减压浓缩，干燥后得荧光标记的含糖醛酸的糖分子。

进一步的：所述步骤(1)中1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺在反应体系中的摩尔浓度均为糖分子中羧基占反应体系的摩尔浓度的2～20倍，反应时间为2～24h。

进一步的：所述步骤(2)中加入的荧光分子在总反应溶液的最终摩尔浓度为羧基占反应体系的摩尔浓度的0.1～10倍。

进一步的：将步骤(2)所述荧光标记的含糖醛酸的糖分子进行如下纯化步骤：将荧光标记的含糖醛酸的糖分子用凝胶色谱柱纯化，采用示差检测器和荧光检测器联用检测，收集示差检测器和荧光检测器重合信号峰；

或将步骤(2)所得荧光标记的糖分子经透析袋透析，检测透析外液电导率不再变化，糖分子组分经减压浓缩后冷冻干燥得荧光标记的糖分子。

进一步的：所述凝胶色谱柱填料为Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25或Bio Gel P2、P4或P6。

进一步的：所述步骤透析袋的截留分子量为1kDa～10kDa。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子在制备用于检测糖分子在体内代谢的检测剂中的应用。

本发明还提供了所述的荧光标记的含糖醛酸的糖分子在制备用于检测糖分子在组织器官中分布的检测剂中的应用。