[发明专利]一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法和应用。该探针是利用苯并咪唑桥连咔唑衍生物构建基于分子内电荷转移效应的pH荧光探针。制法：将苯并咪唑与咔唑衍生物溶于少量N,N‑二甲基甲酰胺，加入三甲基氯硅烷催化，于封管内反应，然后加入饱和Na₂CO₃溶液调节pH至弱碱性，减压浓缩、硅胶柱分离得纯品。该探针具有接近溶酶体pH平衡的pK_a值。对H⁺具有高的灵敏度、好的选择性和大的Stocks位移。该探针在结合H⁺前后颜色变化明显，可裸眼识别。该探针以咔唑衍生物为双光子荧光团，利用双光子荧光成像技术证实该探针与市售绿色溶酶体探针具有良好的共定位性，可应用于HeLa细胞溶酶体内pH变化的检测。

技术领域

本发明涉及溶酶体pH荧光探针，具体是一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，以及该探针在检测细胞内溶酶体pH中的应用。

背景技术

体内pH值与细胞和细胞器的很多重要的生理过程紧密相关。不同的细胞和细胞器有不同的pH平衡值。溶酶体是一种典型的酸性细胞器，其pH值范围为4.5-5.5，异常的溶酶体pH值变化与一种被称为溶酶体贮积症的基因遗传病有关。因此有必要对溶酶体内酸性pH值的变化进行灵敏、准确的实时监测，这对于从分子水平上研究细胞的生理和病理过程具有重要的意义。

迄今为止，文献报道的溶酶体pH荧光探针大多数为单光子荧光探针，通常局限于短波激发(400-560nm)，光损伤和光漂白较大；同样也会对细胞造成光损伤和自体发光，无法应用于实时高分辨检测活组织pH。溶酶体为亚细胞器，检测亚细胞器的pH值容易受到细胞内部环境影响，准确检测亚细胞器内的pH变化就需要高的空间分辨率。而近十年出现的双光子技术由于可以同时吸收两个光子，使其激发波长位于近红外区(700-900nm)，在实现深层透射的同时，避免了紫外光对生物组织的损伤及背景荧光的干扰，可满足亚细胞器(如溶酶体)高分辨检测这一要求。然而具有双光子吸收性能的溶酶体pH荧光探针的报道多为非比率型双光子溶酶体pH荧光探针。这种基于荧光强度变化的单一信号输出容易受到细胞内部环境、探针负载不均、仪器稳定性等因素干扰无法实现定量检测；相反比率型荧光探针借助两个荧光峰的比值变化，结合比率荧光成像可有效地消除这些干扰因素，实现定量检测的目标。因此，迫切需要发展有效的比率型双光子溶酶体pH荧光探针，实现对溶酶体pH波动的灵敏检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针及其制备方法，该溶酶体pH荧光探针应呈现比率荧光发射特性，能实现准确定量检测；目的之二是提供该探针的用途，即在利用双光子成像技术在检测细胞内溶酶体pH变化中的应用。

本发明提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针，其结构式为：

本发明提供的一种苯并咪唑类的双光子溶酶体pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在封管内，将2-甲基苯并咪唑，9-(2-(2-甲氧基乙氧基)乙基)-9H-咔唑-3-甲醛和三甲基氯硅烷按摩尔比1～1.5:1:10～15溶于N,N-二甲基甲酰胺，100～140℃加热反应20～28小时；

(2)向反应液中加入饱和Na₂CO₃溶液调节溶液pH值至弱碱性，搅拌至少0.5小时，用CH₂Cl₂萃取3次，合并有机相，无水Na₂SO₄干燥后，减压蒸馏得到粗品；

(3)粗品经硅胶柱分离，得到纯品。

其合成路线如下：