[发明专利]一种病原性鱼肠道弧菌快速检测试纸

权利要求书

1.一种鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的检测试纸包括载体板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；其中样品垫和吸水垫位于载体板的两端，硝酸纤维素膜位于载体板的中部；样品垫与硝酸纤维素膜交界处设有载有金标兔抗鱼肠道弧菌抗体的金标垫，金标垫一端边缘重叠在样品垫之下，另一端边缘重叠在硝酸纤维素膜之上；其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上从靠近金标垫一侧开始设有依次排列的四条检测线T1、T2、T3、T4和一条质控线C；其中检测线T1为鱼肠道弧菌的外膜蛋白、检测线T2为鞭毛蛋白、检测线T3为鱼肠道弧菌的胞外产物、检测线T4为全菌破碎蛋白；质控线C包被有羊抗兔IgG；

所述的检测线T1、T2、T3、T4上抗原蛋白的划线浓度分别为外膜蛋白0.3mg/mL、鞭毛蛋白0.5mg/mL、胞外产物1.0mg/mL、全菌破碎蛋白0.4mg/mL。

2.如权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的兔抗鱼肠道弧菌抗体的制备方法如下：

将鱼肠道弧菌扩大培养，并将菌液浓度调至1×10⁸CFU/mL，福尔马林灭活后免疫纯种新西兰大白兔；第一次混入弗氏完全佐剂，间隔一周后加强免疫，混入弗氏不完全佐剂，间隔两周后重复一次；一周后取血，分离得到血清，纯化得到兔抗鱼肠道弧菌抗体。

3.如权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的鱼肠道弧菌外膜蛋白，其制备方法如下：

将鱼肠道弧菌扩大培养，离心后磷酸盐缓冲液洗涤，重悬至原体积1/25，加入10％蔗糖，混匀后-20℃下作用15min；室温下加入等体积0.4％Triton-X100，作用一段时间后离心取上清，加入2.5倍体积的冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，洗涤重悬后，加入等体积KI溶液，37℃作用1h；离心取上清，加入2.5倍体积冰乙醇-20℃过夜；离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到鱼肠道弧菌外膜蛋白。

4.如权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的鱼肠道弧菌鞭毛蛋白，其制备方法如下：

将鱼肠道弧菌扩大培养，离心后PBS洗涤、重悬至原体积1/20，用1mol/L HCl调整pH＝2.0，搅拌30min后低温离心取上清；上清液调整pH至中性，加入(NH₃)₂SO₄，4℃放置过夜；低温超高速离心，取沉淀，重悬后透析、冻干得到鱼肠道弧菌鞭毛蛋白。

5.如权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的鱼肠道弧菌胞外产物，其制备方法如下：将鱼肠道弧菌接种于液体培养基中培养后，将液体培养物涂布于预先放置了一层玻璃纸的固体琼脂平板上，37℃培养36h；用PBS洗下菌体，收集菌体后4℃下高速离心；将上清经微孔滤膜过滤，加入(NH₄)₂SO₄，4℃放置过夜；然后低温离心取沉淀，重悬后透析、冻干得到鱼肠道弧菌胞外产物。

6.如权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸，所述的鱼肠道弧菌全菌破碎蛋白，其制备方法如下：

将鱼肠道弧菌扩大培养，菌液置于超声波破碎仪中低温破碎得到全菌破碎液，冻干得到鱼肠道弧菌全菌破碎蛋白。

7.权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸在非疾病诊断治疗目的检测鱼肠道弧菌中的应用。

8.一种非疾病诊断治疗目的检测鱼肠道弧菌的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的鱼肠道弧菌快检测试纸来检测待测样品，所述的方法的判定标准如下：

如果质控线C线呈现红色条带，而检测线T1、T2、T3、T4线皆不显色，结果为鱼肠道弧菌阳性；

如果质控线C线及检测线T1、T2、T3、T4线皆出现红色条带，结果为鱼肠道弧菌阴性；

如果质控线C线及检测线T4检测线显色，而检测线T1、T2、T3线出现1条或多条线不显色，则检测结果为鱼肠道弧菌阴性，但有其他菌的交叉反应。