[发明专利]一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法

权利要求书

1.一种高含量虾青素血球藻的规模化生产方法，其特征在于：包括藻种的培养、种瓶培养、封闭式管道光生物反应器培养、室内池光生物反应器培养和室外池反应器虾青素累积培养；藻种先在实验室内优化的生长条件下，使其快速生长繁殖，待累积到一定的细胞量后，通过无菌管路接种到封闭式管道光生物反应器中进行二级扩大培养，待红球藻生长到一定密度，再接种到室内池式光生物反应器中进行三级生长培养，达到最高藻细胞数，随后将培养完成后的红球藻绿色细胞转入室外池式生物反应器中，在胁迫条件下使其大量累积虾青素，最终完成雨生红球藻的规模化生产流程。

2.根据权利要求1所述的一种高含量虾青素血球藻培养方法，其特征在于：所述的种瓶培养阶段是采取诱变育种的方法筛选出室内外生长均适合，且生长周期短，生产率高，虾青素含量高的藻株，包括如下步骤：

1）EMS诱变：将Haematococcus pluvialis 系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液600ml，4000rpm离心5min，弃上清液；将不同剂量EMS加入到0.06M、pH值为7. 0的磷酸缓冲液中配置得到最终浓度分别为0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的诱变液，分别将藻体加入六种诱变液中在黑暗条件下处理4h，然后加入1ml、5%的硫代硫酸钠终止诱变反应，离心去除诱变液，藻体用新鲜营养液洗涤两次，避光12h后置于光照条件下培养；

2）叠氮钠诱变：将Haematococcus pluvialis 系列雨生红球藻天然藻种培养到对数生长期的藻液900ml均分到9个250ml的三角瓶中，取不同量的叠氮钠溶液加入各个三角瓶中，迅速混匀，使叠氮钠的最终的浓度分别为100 mg/L、120mg/L、140mg/L、160 mg/L、180 mg/L、200mg/L、220mg/L、240mg/L、260mg/L，黑暗中处理12小时，4000rpm离心5min，去除诱变液并用新鲜的营养液洗涤两次，最后将处理后的藻体悬浮到100ml新鲜营养液中，于室温自然光下培养；

3）突变株的筛选：在超净工作台中，将步骤1）和2）处理后的样品分别在固体琼脂平板上划线，之后平板先在光强光照为50~100UM条件下培养，长出绿色藻落后置于200 UM光强条件下诱导虾青素积累，然后挑取藻落大颜色最红的单藻落，分离得到了30个雨生红球藻较优诱变株，再分别接入液体培养液；

4）优良藻株的筛选：将步骤3）筛选出的经过步骤1）EMS诱变的较优诱变株按照步骤2）叠氮钠诱变的方法再次诱变；将步骤3）筛选出的经过步骤2）叠氮钠诱变的较优诱变株按照步骤1）EMS诱变的方法再次诱变；经琼脂平板划线培养再次分离得到30个变异藻株，培养四、五代后详细测定各自的生长速率和虾青素含量，从中找出15个生长速率和虾青素含量排名靠前的藻株；之后连续培养半年，经20多代后，对于各项特征稳定的藻株，再次测其生长和虾青素积累情况，从中找到3个可以用于生产试验的优良藻株；

5）最优藻株的筛选：以BBM培养基作为基础培养基，接种处在对数生长期的优良变异株于三角瓶内，再放入光照培养箱内培养，以浓度为1.25g/L的NaNO₃为氮源，53.3mg/L-80.0mg/L的中高磷浓度； 1g/L以下较低浓度的碳酸氢钠为碳源， 0.25~0.5%的盐度，VB_l2浓度为50~75μg/L，pH值为7.0~8.0，培养温度24士0.5℃，由40W日光灯提供照明，光照强度为90μmol photons·m^-2·s^-1，光周期为12∶12，培养时间10~12d，每天定时摇瓶三次，防止细胞贴壁，从中选出最优藻株。

3.根据权利要求1所述的一种高含量虾青素血球藻培养方法，其特征在于：当所述的封闭式管道光生物反应器为柱式光生物反应器时，其聚乙烯透明塑料袋的底部逐渐窄缩成漏斗状，保证其底部四周藻液充分流动，营养分布均匀一致，氧气解析和二氧化碳交换补偿充分，采用环形牵引支架增强其抗倒伏性。