[发明专利]一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，进一步涉及重组蛋白表达系统的构建技术，具体涉及一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法。

背景技术

糖尿病是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。

目前，我国Ⅱ型糖尿病的患病率增长较快，据1979年在我国30万人口中的调查，糖尿病患病率为0.6％，1989年为2.02％，年均增长0.1％左右，1994年我国普查20万人口，患病率已上升为2.5％，目前20～75岁人群中糖尿病患病率约为3％左右。糖耐量低减患者不低于3％。一般而言，在我国富裕地区的糖尿病患病率高于贫困地区，城市高于农村，肥胖高于正常体重，高龄高于低龄。目前我国糖尿病发病率为1/1000左右，50岁以上的平均患病率为7％以上，40岁以下患病率随着年龄的增长而升高，患者高峰年龄在50～70岁。

我国患病率以北京、辽宁、宁夏、甘肃、云南、福建较高，据1979～1997年调查结果表明为全国之首，而新疆、贵州、山西较低。发病率较高的北京、辽宁与最低的贵州、新疆之间相差达10倍，城市发病率高于农村1～4倍，广西地区调查证明，产糖地区糖尿病患病率高于非产糖区2倍。

尽管多种治疗方法可以控制血糖浓度，但目前仍未实现糖尿病的根治。现有技术中，药物干预仍是糖尿病治疗的主要手段，其中以GLP-1类似物、DPPIV抑制剂等应用较为广泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein)，是指可诱导胰腺中β细胞增殖、进而促进胰岛素分泌的一类功能性蛋白，由于其不直接参与人体糖代谢机制，因此降糖作用较为温和，对人体副作用较小。然而，此类蛋白的规模化生产是目前制约其临床应用的直接技术问题，其中人源蛋白的获取较为困难，而其他生物来源的pBpp蛋白其药效及安全性又难以得到保障。此外，尽管具有确切的β细胞增殖诱导效果，但由于pBpp蛋白对胰岛细胞靶向性不高，因此在一定程度上影响了pBpp蛋白的药效。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株及其功能验证方法，以解决现有技术中缺乏一种pBpp蛋白表达系统的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是常规的在利用pBpp蛋白进行血糖调节的过程中，pBpp蛋白本身缺乏靶向性。

本发明要解决的再一技术问题是现有技术中pBpp蛋白表达菌株对哺乳动物血糖的调节效果难以得到准确的量化考察。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株，该菌株是由以下方法制备的：

1)以斑马鱼粪便菌群的总DNA为模板，以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分别为上、下游引物执行PCR扩增，得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段，即为pBpp蛋白表达基因；

2)取步骤1)所获得的pBpp蛋白表达基因，连接到Abvec载体上，即得到重组质粒Abvec-pBpp；

3)取步骤2)所得的重组质粒Abvec-pBpp，转入大肠杆菌E.coli Top10中，得到重组菌株；

4)培养步骤3)所得的重组菌株，从中提取重组质粒Abvec-pBpp，将其通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009中，通过氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆，得到重组表达菌株Abvec-pBpp-VNP20009，即为所述减毒鼠伤寒沙门氏菌介导的pBpp重组蛋白表达菌株。

作为优选，步骤2)中pBpp蛋白表达基因与Abvec载体的连接是先经Age I和Bsiw I双酶切，酶切产物纯化后采用T4连接酶连接到Abvec载体上。

作为优选，步骤4)所述的电转法包括以下步骤：取重组质粒Abvec-pBpp与所述处于感受态的鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株在电转杯中混合，而后以电压1.8kv、电阻200Ω、电容25uF的条件电转4.7ms。

作为优选，步骤4)所述感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009，是通过以下方法制备的：

A)取冻存的减毒鼠伤寒沙门氏菌VNP20009株划线接种于LB固体培养基培养至形成单菌落；