[发明专利]一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法

说明书

本发明公开了一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法，本发明中的CDs荧光信号稳定、尺寸小，较其他的荧光量子点具有水溶性好和生物毒性低等优势，不仅能够克服同位素示踪、电子自旋共振，色谱分析等技术的缺陷，且具检测线性范围广、精密度高、检测限低等优势。

技术领域

本发明属于活性氧检测技术领域，具体涉及一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法。

背景技术

活性氧对生物体十分重要，但过量会对生物体产生氧化损伤导致细胞死亡。由于活性氧寿命短、反应活性高，且大部分都存在于体内很难被捕获，因此活体中ROS的直接检测对于解释生命机体的各种生理反应有着重要的意义。目前能够用于解决该问题的方法比较有限，已报道的电子顺磁共振技术(electron paramagnetic resonance，EPR)是一种检测自由基的波谱学方法，可以直接检测·O₂^-、·OH等活性氧自由基及参与其形成的过渡金属离子的化学变化。电子自旋共振，色谱分析等技术已被广泛应用在活性氧的研究中。这些检测技术精度高，但存在需要昂贵的实验设备，且实验过程复杂，检测工作量大，受限因素多等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法。

本发明的技术方案如下：

一种浮游植物细胞内外活性氧的检测方法，包括如下步骤：

(1)取近海典型浮游植物于f/2培养基中进行培养，该f/2培养基中含有用以标记近海典型浮游植物的SA-CD_s，获得SA-CD_s标记培养液，具体培养条件如下：f/2培养基中含有14～16mg/L CDs，置于光照强度为130～150μmol photons(m²s)^-1，光暗比为12～15h∶8～10h，温度为18～20℃生化培养箱中培养，以80～120rpm搅拌海藻悬浮液模拟海水流动，同时减少CDs在容器壁上吸附；

(2)以H₂O₂溶液作为活性氧标准液，根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的荧光强度变化的情况，获得第一线性工作曲线：y＝0.2599x+2.404，其线性范围6-150ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示荧光强度；根据上述SA-CDs在不同浓度的活性氧标准液的显色吸光度变化情况，获得第二线性工作曲线：y＝-0.0002x+0.1941，其线性范围为3-400ng/L，其中x表示H₂O₂浓度，y表示吸光强度；

(3)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞悬浮于适量海水中，于17～19℃同时在高压汞灯持续照射下，以80～100rpm的速度持续搅拌0.8～1.2h，然后取适量进行超声波破碎，得破碎液，在破碎液中加入适量FeCl₃溶液后于激发波长343nm，发射波长440nm下扫描其荧光光谱Slit 2.5/5，记录试剂空白和试液的荧光强度F₀和F₁，计算荧光强度变化值ΔF＝F₀-F₁，最后将该荧光强度变化值ΔF作为y代入步骤(2)所得的第一线性工作曲线，所得x即为藻细胞内活性氧浓度检测结果；

(4)步骤(1)获得的SA-CDs标记培养液中的藻细胞悬浮于适量海水中，于17～19℃同时在高压汞灯持续照射下，以80～100rpm的速度持续搅拌0.8～1.2h，得细胞悬浮液，在该细胞悬浮液中加入适量FeCl₃溶液后于波长λ525检测吸光强度，最后将该吸光强度作为y代入步骤(2)所得的第二线性工作曲线，所得x即为藻细胞外活性氧浓度检测结果。

在本发明的一个优选实施方案中，所述近海典型浮游植物包括威氏海链藻CCMA-102和小球藻CCMA-410。