[发明专利]一种人类精子顶体反应能力检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及人类精子检测领域，尤其是涉及一种人类精子顶体反应能力的检测方法。

背景技术

随着经济的发展和医疗水平的提高，不孕不育的发病率反而呈增长趋势，已成为当今影响人类生活和健康的一类主要疾病，其中在我国，不孕不育症在育龄期夫妇中发病率达10％以上，并有逐渐增多的趋势。男性因素和女性因素各占30％，双方共同因素占40％。男性因素中精子原因居首位。世界卫生组织(WHO)在25个国家9000对不育夫妇的多中心研究中发现，50％的男性不育症是特发性精子异常。精子授精能力与顶体有极为密切的关系。精卵结合的过程，是通过顶体破裂释放顶体酶，使精子穿越卵丘透明带而完成的。正常的精子顶体及顶体反应是精卵结合的必要条件。在识别、结合卵子透明带的过程中，顶体被诱导发生顶体反应，从而实现精子DNA与卵子DNA融合的重要功能，因此精子顶体完整性与发生顶体反应是评估精子受精功能的重要指标。因此，亟需一种人类精子顶体反应能力检测的方法来评估精子受精功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单且方便快速、结果易于判定、检测结果准确、稳定可靠、重复性好的人类精子顶体反应能力检测的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种人类精子顶体反应能力检测的方法，包括如下步骤：

(1)取500μL液化的精液，从含有37℃预热的600μL上游液的样本管底部缓缓加入，用上游法优选精子15min；

(2)上游结束后吸取400μL优化好的精子悬液，分成两份于流式上样管中，每管200μL，检测管加入10μL顶体反应诱导剂，对照管加入10μL顶体反应诱导剂溶剂，37℃避光诱导15min；

(3)诱导顶体反应结束后，7000r/min离心2min，去上清后，加入200μL预冷的70wt％乙醇水溶液振荡混匀，室温固定2min，再以7000r/min离心2min，去上清；

(4)两管中各加500μL缓冲液，振荡混匀重悬精子，再加入5μL的FITC-PSA染液，37℃避光染色15min；

(5)设定流式细胞仪的校准，对照管、检测管按顺序上机，每管样本至少连续测定两次，每管样本至少记录样本主群5000个细胞并使用AR计算软件统计分析；

(6)依据软件计算出的结果，顶体反应发生率即为通过Ca²⁺载体诱导产生的发生顶体反应的精子群百分比减去在自然状态下自发进行的顶体反应精子群百分比(这些则是通过诱导之后能够发生顶体反应的精子群体，该群体直接影响的受精发生比率)，获得的百分比差值大于15％即为正常人群数值，低于15％的则可能为异常人群；

(7)测定后，分别用漂白剂、进样管清洁剂和除菌的双蒸水彻底清除残留于流式细胞仪进样线中的细胞碎片和荧光染料。

步骤(1)中所述的上游液为氯化钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、氯化钾、酸镁、氯化钙、N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸二钠盐、碳酸氢钠、丙酮酸钠、牛血清白蛋白和乳酸钠的混合物。

步骤(2)中所述的顶体反应诱导剂为Ca²⁺载体A23187和二甲基亚砜的混合物，所述的顶体反应诱导剂溶剂为二甲基亚砜。

步骤(4)中所述的缓冲液为氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾的混合物。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种人类精子顶体反应能力检测的方法，采用Ca²⁺载体诱导顶体反应发生、异硫氰酸耦联的豌豆凝集素(FITC-PSA)作为染料来检测人类精子顶体反应能力。人类精子顶体含有大量糖蛋白，能与FITC耦联的豌豆凝集素(FITC-PSA)特异性结合。顶体功能异常未发生顶体反应的精子具有完整的顶体，顶体内容物能够与FITC-PSA特异结合，精子头部发高强度绿色荧光；顶体功能正常时发生顶体反应，反应后的精子顶体内容物释放，不结合或很少结合FITC-PSA，精子不发荧光或弱荧光，具有操作简单、结果易于判定、检测结果准确、稳定可靠、重复性好方便快速。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例

一种人类精子顶体反应能力检测的方法，其特征在于包括如下步骤：