[发明专利]一种基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法

说明书

技术领域

基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

丙溴磷是一种中等毒性的非内吸性广谱有机磷杀虫剂，具有触杀和胃毒作用，对棉花、果树、水稻、蔬菜等作物上的害虫有很好的防治效果。使用量日渐增多,因在蔬菜上的使用而产生的污染不容忽视。虽然少量的丙溴磷残留不会对人体造成立即的、直接的毒害,但是丙溴磷的分子结构比较稳定,在生物体内很难被代谢分解、排泄,长期食用这种受污染的蔬菜可导致癌症、不孕症、内分泌紊乱等疾病。大量进食超标蔬菜,会危害神经中枢,以致痉挛而死。我国政府规定水果和蔬菜中丙溴磷的最大残留剂量(MRL)分别为0.2和0.5mgkg^-1。

目前一般通过检测蔬菜中农药的残留来判断蔬菜受农药污染的程度,所以对蔬菜中农药残留量测定的研究报道较多,至今，用于检测丙溴磷的方法多为气相色谱分析法(GC)、高效液相色谱分析法(HPLC)，以及气相色谱和液相色谱同质谱联用(HPLC-MS,GC-MS)。尽管这些方法是可靠、有效、实用的，但是它们多不够简便、快速、高效，并且费时、昂贵及需要专业的技术人员。本研究意在建立一种简便、快速、特性性强、高效的丙溴磷残留量检测技术,满足执法者和消费者的迫切需要。由于它的低费用、便于操作、反应迅速、特别高的特异性，是一种很有前途的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于荧光探针铽离子建立非标记核酸适配体传感器检测丙溴磷的方法,以快速、简单、灵敏的检测丙溴磷的残留量。

技术问题：基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法基于以下原理：

铽离子在游离状态下时几乎没有荧光，单链DNA(尤其是富含G的)有助于增强铽的激发但双链DNA不能，能量从单链DNA转移到铽使得荧光强度增加。在只有富含G的核苷酸单链上与铽离子结合时，有很强的荧光效果；加入能够与富含G的核苷酸单链上发生碱基互补的丙溴磷的核酸适配体时，它们之间会通过碱基间互补作用力发生结合，形成双链结构，再结合铽离子，铽离子的荧光强度会减弱；当加入目标物后，丙溴磷的适配体会优先通过特异性识别作用，与目标物形成特殊的二级结构，从而释放富含G的核苷酸单链上，此时释放的核苷酸单链与铽离子结合，又会使荧光强度恢复。本研究方法就是通过这种荧光强度的变化，可以实现对丙溴磷的特异性检测。

本发明的技术方案：

包括以下步骤：反应体系的建立；通过测定荧光光谱图观察适配体、帮助链、铽离子以及丙溴磷体系的反应；通过荧光探针铽离子的非标记核酸适配体传感器检测丙溴磷并进行实际样品的检测。

(1)反应体系的建立

设计了一条富含G且又能与丙溴磷核苷酸适配体碱基部分互补的发夹帮助链，首先是单独的帮助链室温条件下与铽离子反应14min，其次是先加入丙溴磷核苷酸适配体与其帮助链室温条件下反应16min，再加入铽离子与其反应。

利用RF-5301荧光分光光度仪测定以上反应，荧光信号分别为F₀和F₁

(2)通过测定荧光光谱图观察适配体、帮助链、铽离子以及丙溴磷体系的反应

取3个2.0mL的离心管，编号为a,b,c，分别依次加入，a管(4μM帮助链50μL,10μM的铽离子50μL,pH7.9的Tris-盐酸缓冲液400μL),b管(4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,10μM的铽离子50μL,pH7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL),c管(4μM帮助链50μL,6μM核酸适配体50μL,10μM的铽离子50μL,2μM的丙溴磷50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液300μL),在290nm的激发波长条件下测定荧光吸收光谱。

(3)建立基于铽和适配体的丙溴磷荧光检测方法

向含有6μM核酸适配体50μL,分别加入不同浓度的丙溴磷标准溶液,反应16min后，加入4μM帮助链50μL，10μM的铽离子50μL,pH 7.9的Tris-盐酸缓冲液350μL的混合体系中，室温条件下反应14min，测定该体系的荧光信号强度，铽离子的荧光信号强度将随着丙溴磷浓度的不同而发生变化。根据F₁和F₂与丙溴磷的浓度建立标准曲线。(F₁和F₂分别为加入丙溴磷之前和之后的荧光信号强度)