[发明专利]烟粉虱噻虫嗪抗性基因CYP4C64及其启动子

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域和植物虫害防治领域，具体涉及烟粉虱噻虫嗪抗性基因及其启动子。

背景技术

烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius)，是世界性的农业害虫，给生产带了极大的危害。20世纪80年代以后，陆续分布于全球除南极洲外各大洲的90余个国家和地区，且寄住植物多达74科500多种。在中国，该害虫在90年代末期成为我国重要的经济作物害虫，主要为害种类为B生物型，由于其入侵性强危害性大又被冠以“超级害虫”；Q生物型烟粉虱于2003年首次由本实验室在云南地区花卉市场被发现，之后快速扩散到全国各地，目前这两种生物型烟粉虱是我国蔬菜和花卉等作物上危害最大的生物型。烟粉虱不仅直接刺吸植物汁液，造成植株衰弱、干枯，而且还传播植物病毒病。由烟粉虱作为传毒媒介而引起的危害甚至使部分地区整棚番茄绝收，给生存带来了极其严重的危害。鉴于烟粉虱直接危害和间接危害的严重性，在农业生产中烟粉虱的防治工作已经到了刻不容缓的地步。

烟粉虱主要以化学防治为主，杀虫剂的过量使用，导致烟粉虱已对各种防治用药产生了不同程度的抗性，尤其对防治烟粉虱使用最长、应用范围最广的新烟碱类杀虫剂抗药性最强。噻虫嗪是第二代全新结构的新烟碱类杀虫剂，自2000年进入中国市场后，一直是防治烟粉虱的首选。首次发现烟粉虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性是在西班牙南部的园艺生产区，后不久又在以色列和西班牙相继发现接近1000倍的烟粉虱噻虫嗪抗性种群，且高抗种群对其它烟碱类药剂存在显著交互抗性。近年来，我国的北京、江苏、浙江、新疆、湖北等全国大多数省份也陆续有烟粉虱对新烟碱类药剂产生抗性的报道，而且我国北至黑龙江、南至海南、西至青海、东到上海的大部分地区均有烟粉虱分布和危害，危害生物型主要为Q型和B型，且抗药性普遍很高。因此抗药性是导致烟粉虱大爆发且难以治理的主要原因之一。

害虫抗药性治理依赖于害虫抗性机制的阐明，但目前人们对烟粉虱抗新烟碱类杀虫剂的抗性机制仍“知之甚少”。有关新烟碱类杀虫剂的作用机制，人们普遍认为，其主要作为后突触烟碱乙酰胆碱受体（nAChRs）的激动剂，作用于昆虫的中枢神经系统而使昆虫抽搐麻痹死亡。因此，关于新烟碱类杀虫剂抗性机制研究一般集中在nAChRs，如在桃蚜、果蝇、稻飞虱、疟蚊、以及蜜蜂等昆虫中均发现nAChRs突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关。除靶标不敏感性外，昆虫对新烟碱类杀虫剂的抗性机制也和代谢机制有关，如最近在桃蚜、家蝇、褐飞虱中均发现细胞色素P450氧化酶基因介导的代谢解毒与噻虫嗪抗性有关。而在烟粉虱中，至今没有发现nAChRs的突变与新烟碱类杀虫剂抗性有关的报道，但是通过生化和分子生物学手段发现一种细胞色素P450基因（CYP6CM1）和吡虫啉抗性有关。

发明内容

本发明人利用转录组技术获得大量P450基因片段序列，并以噻虫嗪抗性和敏感品系为实验材料进行荧光定量PCR进行表达量验证，结果发现抗性品系中P450基因CYP4C64的表达量显著升高，并且通过田间样品检测发现该基因与噻虫嗪抗性极其相关，在此基础上进行了上游启动子序列克隆，并且应用双荧光素酶系统进行分析，发现上游-603bp内存在启动子序列，国内尚未有关于田间烟碱类杀虫剂抗药性基因CYP4C64启动子分析相关报道。

本发明提供一种编码烟粉虱噻虫嗪抗性蛋白的抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；同时，本发明还提供所述的抗性基因编码的烟粉虱噻虫嗪抗性蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明人通过烟粉虱基因组序列查找CYP4C64上游序列，设计引物，以烟粉虱总的DNA为模板PCR克隆相应的片段序列。

本发明还提供所述的抗性基因的表达载体或重组细胞系，将获得的目的片段利用高保真酶transtart fastPFU fly DNA polymerase PCR获得含有平末端的序列，然后连接到EcoRV单酶切（该酶为平末端酶）回收后的pGL4.10表达载体上，挑选克隆斑后进行菌液PCR验证，测序连接方向正确后应用天根无内毒素质粒提取试剂盒进行质粒提取备用。

本发明所述的抗性基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明所述的抗性基因可用于检测烟粉虱对吡虫啉或噻虫嗪的抗性基因，同时也为新的农药靶标设计位点提供理论基础。