[发明专利]特异吸附c‑Myc标签单域重链抗体的免疫亲和材料

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于单域重链抗体(又称纳米抗体技术)的免疫亲和吸附材料，特别是针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料。

技术背景

c-Myc标签蛋白的发现源于1985年Evan制备获得了一株针对人原癌基因产物Myc蛋白的单克隆抗体9E10，此后研究发现该抗体识别的表位由 10个氨基酸残基组成，其序列为Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp -Leu，并且这10个氨基酸与其它蛋白融合表达后依然能够保持很强的抗原活性，可以被相应抗体识别，而且不受到蛋白框架的影响。因此，c-Myc 标签系统广泛应用于免疫学检测、细胞成像、亲和纯化以及蛋白质工程等领域。

免疫亲和层析、免疫亲和磁珠及免疫共沉淀等技术常用于分离纯化含有c-Myc标签融合蛋白。这类亲和纯化技术基于配基与c-Myc标签特异性结合的原理，一般地，将特异性结合c-Myc标签的配基与载体偶联或吸附，然后用于从溶液中特异性吸附c-Myc标签融合蛋白。

市场上针对c-Myc标签融合蛋白纯化用的亲和柱和亲和磁珠，偶联的配基大都是单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体的研发和生产过程较为繁琐和复杂，多克隆抗体来源有限。现有的针对c-Myc标签融合蛋白纯化的亲和柱和亲和磁珠价格普遍偏高。而纳米抗体可以在大肠杆菌、酵母等生物中大量表达，有利于降低相关制品的生产成本。

蛋白纯化过程中需要用到酸或碱性溶液对目的蛋白进行洗脱。由于单克隆抗体或多克隆抗体由重链和轻链组成，酸碱洗脱会不可避免的导致抗体活性降低，因而不能重复使用。相比之下，单域重链抗体仅由一个结构域组成，具有耐酸碱、耐高温。本发明中提供的亲和吸附材料可重复多次使用。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

针对c-Myc标签的免疫亲和吸附材料包括载体和配基，所述配基为单域重链抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。该配基可特异性识别c-Myc标签。

所述配基还可以为在前述单域重链抗体基础上通过随机或定点突变技术进行改造所获得的能与c-Myc标签特异性结合的抗体。

所述载体为磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。

上述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的制备方法，其特征为：

所述载体为磁珠时，制备方法为：取1mg羧基磁珠于离心管中，加入600～1000μl活化缓冲液(10mM，NaH₂PO₄，pH 6.0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用活化缓冲液洗涤2遍。分别加入1～5mg碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后，静置35min。用偶联缓冲液(10mM，Na₂HPO₄，pH 7.4)洗涤磁珠5遍，加入抗c-Myc 标签单域重链抗体，室温反应3～5h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫磁珠；

所述载体为琼脂糖凝胶微球时，制备方法为：将CNBr活化的干胶用 0.1M HCl洗涤10～20次，每次平衡6～10min。用偶联缓冲液(10mM， Na2HPO4，pH 7.2)洗涤5～20次，加入抗c-Myc标签单域重链抗体，室温反应3～10h，得到共价偶联了抗c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料；

所述载体为硅胶微球时，制备方法为：将硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(PBS，10mM，pH 6.5)交替洗涤5～15次，用PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入抗c-Myc标签单域重链抗体，混匀，加入终浓度1～10mg/ml的碳二亚胺(EDC)，迅速混匀，4℃搅拌反应12～20h，得到共价偶联了抗 c-Myc标签单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。

将上述免疫亲和吸附材料(载体为琼脂糖凝胶微球和硅胶微球)装填至层析柱，即得到c-Myc标签免疫亲和层析柱，方法为：根据层析柱容量，取适量上述免疫亲和吸附材料于层析柱，加入8～10倍柱床体积的PBS(10 mM，pH 7.2)洗涤后，4℃，保存于20％乙醇溶液。

本发明还涉及装载有权利要求1所述c-Myc标签免疫亲和吸附材料的亲和层析柱。