[发明专利]提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法

权利要求书

1.一种提高安丝菌素P-3生物合成产量的方法，其特征在于，通过构建共表达asm13-17基因和asmUdpg基因所对应的整合型表达质粒pIB139-asm13-17:asmUdpg，并将上述表达质粒转入珍贵橙色束丝放线菌(Actinosynnema pretiosum)中，实现生物合成表达量的提高；

所述的asm13-17基因是甲基丙二酰ACP合成酶基因，如Seq No.1所示；所述的asmUdpg基因是UDP-葡萄糖磷酸酶基因，如Seq No.2所示；

所述的质粒构建，具体过程步骤包括：

①PCR扩增珍贵橙色束丝放线菌目的片段基因，将目的片段插入T载体中，采用NdeI/EcoRI酶切并连接至含有红霉素启动子PermE*的pIB139载体中，得到pIB139-asm13-17、pIB139-asmUdpg以及pIB139-asm13-17: asmUdpg质粒；

②将共表达质粒转入含有pUZ8002质粒的大肠杆菌ET12567中，然后将等量混合收集大肠杆菌ET12567/PUZ8002和预先培养的珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565菌丝体混合均匀，再通过平板培养得到突变株结合子；

③通过阿泊拉霉素抗性进行重组菌株的筛选，并通过PCR产物片段进一步验证得到橙色束丝放线菌的重组菌株，经发酵培养后，实现安丝菌素P-3生物合成产量的提高；

所述的pIB139-asm13-17，具体通过以下方式得到：以137F/137R引物通过PCR扩增得到长度为4,451 bp的两端含有NdeI/EcoRI酶切位点的asm13-17片段，将得到的基因片段，连接到pMD^@19-T载体上，得到asm13-17-19T；通过NdeI/EcoRI酶切，与相应酶切后的pIB139质粒的连接，得到用于asm13-17基因表达的质粒pIB139-asm13-17；

所述的137F/137R引物包括：asm13-17-上游引物(137F)，如Seq ID No.3所示，具体为：5’- GGGAATTCCATATGGTGCCCGGCGACACCGAC -3’；asm13-17-下游引物(137R)，如Seq IDNo.4所示，具体为：5’- CCGGAATTCTCACTGGTCTCCAAGGCGCG -3’，其中划线部分是相应的酶切位点；

所述的pIB139-asmUdpg，具体通过PCR扩增珍贵橙色束丝放线菌ATCC31565基因组中asmUdpg基因，具体为：在珍贵橙色束丝放线菌asmUdpg基因片段两端设计UdF/UdR引物，分别在基因前后分别加上NdeI和EcoRI酶切位点，将扩增到的不带原始启动子的asmUdpg片段插入T载体中构建的UDP-T质粒；用NdeI和EcoRI将asmUdpg片段切下插入含有红霉素启动子PermE*的pIB139载体中，得到pIB139-asmUdpg质粒；

所述的UdF/UdR引物包括：Udpg-上游引物(UdF)，如Seq ID No.5所示，具体为：5’-CGCCATATGGCAGGACAGCCTAAGGAC -3’;Udpg -下游引物(UdR)，如Seq ID No.6所示，具体为：5’- CCGGAATTCTGTGCTCATACCTCGTTCATGC -3’；

所述的pIB139-asm13-17: asmUdpg，具体通过用含有酶切位点的MunI-ermE-F/UdR-EcoRI引物以pIB139-asmUdpg质粒为模板扩增(MunI)-PermE-asmUdpg-(EcoRI)片段，连接T载体后构建UDP-T2质粒，用MunI和EcoRI将PermE-asmUdpg片段切下插入EcoRI单酶切的pIB139-asm13-17质粒中，验证方向后，得到pIB139-asm13-17: asmUdpg质粒；

所述的ermE-F/UdR引物包括：ermE-上游引物(ermE-F)，如Seq ID No.7所示，具体为：5’- CCGCAATTGTATGCATGCGAGTGTCCGTT -3’,其中划线部分是相应的酶切位点。