[发明专利]败血症中革兰氏阴性病原菌分离的新方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是涉及基于磁性纳米粒子的革兰氏阴性病原菌分离方法。

背景技术

败血症是严重的全身性感染疾病,病情复杂多变,病死率高。败血症患者血液中的病原菌主要包括革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴病原菌。在治疗过程中，革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴性病原菌细胞壁结构差别较大，选用药物也有一定差别。传统的鉴别败血症患者血液中病原菌种类的方法主要是血平板培养法，但该方法周期长，大概需要5-7天，在这一过程中很可能会使病人的病情进一步加重。另外，如若不对血液中病原菌进行分类，就只能使用广谱的抗菌素。近年来，随着人类广谱和超广谱抗生素的大量生产和应用，导致多重耐药菌、条件病原菌引起的各类感染增加，抗生素的选择范围缩小。目前全球细菌耐药形势空前严峻，细菌耐药已被列为威胁人类健康的三大难题之一。同时，广谱和超广谱抗菌素还会对肠道中的益生菌产生抑制作用，从而对健康产生一定的危害。因此，为了提高对败血症患者的治疗效果,在治疗前对患者血液中的病原菌种类进行鉴别，能够指导临床更加科学合理使用抗菌药物。因此，建立一种高效、快速检测革兰氏阴性病原菌的新方法显得尤为迫切。鉴于需要建立一种高效，快速的检测方法，基于功能化的磁性纳米粒子的分离技术在病原菌监测中得到了迅速发展。

临床上应用的传统鉴别革兰氏阴性病原菌和革兰氏阴性病原菌的方法，主要是血平板培养法。该方法不但周期长，而且耗费大量的人力物力。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低梯度磁场下，简便、快捷，高效的磁富集分离患者血液中的革兰氏阴性病原菌的方法。

革兰氏阴性病原菌的快速分离方法，包括以下步骤：(1)吸取2mL的磁性纳米粒子(10mg/mL)，加入到8mL pH＝7.4的无菌的PBS溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤后的磁性纳米粒子重悬于10mL无菌的PBS溶液中；(2)5.8mg EDC，溶于290μL无菌的PBS中，6.5mg NHSS，溶于325μL无菌的PBS中，然后将溶解后的EDC和NHSS加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的PBS洗涤3次，重悬于8mL无菌的PBS溶液中；(4)称取链霉亲和素0.5mg，溶解到100μL灭菌的PBS溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反应2h，然后用灭菌的PBS洗涤3次，重悬于8mL灭菌的PBS溶液中得到链霉亲和素修饰的磁珠；(5)称取10mg刀豆蛋白A，溶于400μL灭菌的PBS溶液中，1mg长链生物素，溶于100μL灭菌的PBS溶液中，然后将溶解后的长链生物素加入到溶解的刀豆蛋白A中，孵育2h，用30kDa的超滤管在8℃、3000rpm条件下冷冻离心，用10个体积灭菌的PBS不断清洗，得到生物素化的刀豆蛋白A；(6)将生物素化的刀豆蛋白A加入到链霉亲和素修饰的磁珠中，孵育45min；(7)反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，得到终浓度为2mg/mL的刀豆蛋白A-磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阴性病原菌。(8)取10mL待测样品溶液，加入1mg刀豆蛋白A-磁性纳米粒子复合物，置于培养箱上，以200rpm的转速37℃孵育45min；插入磁力架分离6min；(9)磁分离后，无菌PBS溶液清洗后，用无菌的PBS缓冲液重悬即得富集有革兰氏阴性病原菌-刀豆蛋白A-磁性纳米粒子复合物。

所述半刀豆球蛋白，其分子量为102000Da。

所述纳米磁性纳米粒子粒径为180nm，表面羧基。

刀豆蛋白A通过氨基与长链生物素的活泼酯反应脱去N-羟基琥珀酰亚胺，使二者相连，然后长链生物素的另一端生物素与磁珠表面的链霉亲和素相连，刀豆蛋白A与革兰氏阴性病原菌表面甘露型的糖结合时，通过天冬氨酸的两个氧原子作为受体与糖的6-OH和4-OH形成氢键、天冬酰胺的氮原子作为供体与糖的3-OH形成氧键、甘氨酸的主链和单糖的3-OH形成氢键。

具体原理见图1。

本方法适用于富集分离复杂复杂基质中分离革兰氏阴性病原菌，如裂解血，血清，以及全血样品。

采用本发明技术方案具有如下有益效果：

1、本发明采用的是180nm的磁性纳米粒子，主要用于血液中目标菌的快速富集，而采用30nm或者50nm纳米磁珠结合树状分子的富集方法是用于磁信号的放大。