[发明专利]一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法

说明书

本发明公开了一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法。包括将肠管剪切为10‑12cm的肠段，洗脱肠管表面杂质和肠管表面粘液后，以含EDTA和EGTA的消化液B洗脱肠上皮细胞层，再以含Liberase TL和DNase I的消化液C消化；最后以流式细胞仪进行分选得到小鼠肠道固有层原代树突状细胞。利用本发明所述方法分离得到的原代树突状细胞纯度较高、表型特征完整。

技术领域

本发明属于生物领域，涉及一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法。

背景技术

肠道主要由上皮层、固有层及浆膜层构成，其中上皮层主要为一层扁平上皮细胞，而固有层内含有种类丰富、数目繁多的免疫细胞，是哺乳动物识别、捕获经消化道进入体内的外界病原微生物的重要场所，肠道固有层免疫紊乱与感染、肿瘤、炎症性肠病等多种疾病密切相关。树突状细胞是最重要的免疫细胞之一，针对树突状细胞的研究有助于提升抗感染、抗肿瘤等临床诊疗水平，改善广大患者的预后。对肠道固有层中的原代树突状细胞进行分离、纯化是开展此类研究的前提条件之一。

当前原代细胞分离的主要方法包括：机械解离法、酶学解离法与螯合剂解离法。机械解离法多采用剪刀剪切、吸管吹打、注射针头或纱网挤压过滤等方法分散组织细胞。此法虽然简便快速，但对细胞的机械损伤过大、分散效果差，因此极少用于原代细胞的分离。酶学解离法多使用胰蛋白酶或胶原酶，利用酶对细胞间质或细胞间连接的消化作用，达到使原代细胞分离的目的，但此方法具有消化时间长(对细胞的潜在毒性大)、酶浓度与活力欠稳定、对环境温度及PH要求高等不足，因此适用范围偏窄。螯合剂解离法常使用EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)，EDTA能够与细胞表面的钙、镁等二价离子结合形成螯合物，结合后的机械力能够使细胞变圆而分离。该法具有解离时间短、解离效应稳定、对环境要求低(不需要恒温、恒定PH等)等优势，尤其适用于上皮细胞的解离，但对原代细胞的损伤程度大于酶学解离法。另外，在原代细胞分离过程中，由于部分组织细胞被破坏，释放出核内的染色质，这些染色质具有很强的粘性，导致原代细胞间显著粘连，甚至形成胶冻状，严重阻碍细胞的进一步解离。

目前分离固有层细胞的主要方法是将小肠剪切为3-4cm片段，再加入消化酶(如胶原酶IV)或螯合剂(如EDTA)对细胞进一步分离。此方法的弊端包括：①对小肠多次剪切导致机械性损伤过大；②未将上皮层、固有层与浆膜层的细胞逐一消化，混合消化势必造成上皮层与浆膜层细胞对固有层细胞干扰过大、固有层细胞纯度显著降低；③树突状细胞具有敏感、脆弱、易死亡等特点，单纯酶学解离法消化时间过长、单纯螯合剂解离法细胞损伤过重，因此均难以达到满意效果。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法，包括将肠管剪切为10-12cm的肠段，洗脱肠管表面杂质和肠管表面粘液后，以含EDTA和EGTA的消化液B洗脱肠上皮细胞层，再以含Liberase TL和DNase I的消化液C消化；最后以流式细胞仪进行分选得到小鼠肠道固有层原代树突状细胞。

一种小鼠肠道固有层原代树突状细胞的分离方法，优选包括如下步骤：

(1)将肠管剪切为每段长10-12cm的肠段，用聚乙烯细管将肠管翻转并用细线结扎固定，使肠管肠上皮细胞层暴露，并浸泡在装有平衡盐溶液B的试管中，并多次摇晃试管、更换平衡盐溶液B以洗脱肠管表面杂质；

(2)将平衡盐溶液B更换为消化液A，摇晃试管以洗脱肠管表面粘液；

(3)将消化液A更换为平衡盐溶液B，使用平衡盐溶液B再次清洗肠管多次，以中和消化液A；