[发明专利]一种分离高纯度尿液外泌体的方法和试剂盒

说明书

本发明提供一种分离高纯度尿液外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、尿液样品离心，弃沉淀，收集上清；步骤二、上清用滤头过滤，收集过滤液；步骤三、将步骤二得到的过滤液装入透析袋中透析得到外泌体；步骤四、将步骤三中获得的外泌体在超滤管中超滤最终得到浓缩的尿液外泌体。本发明还提供一种分离高纯度尿液外泌体的试剂盒。本发明相比于目前常规的尿液外泌体分离方法，具有成本低、操作简单、产率和纯度高且外泌体结构完整等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种分离高纯度尿液外泌体的方法和试剂盒。

背景技术

外泌体(exosome)是一种很多细胞都能分泌的直径约30-150nm的包含有多种蛋白质和RNA的膜性囊泡，具有在细胞之间传递信息的功能。不同的细胞可能分泌特异性的蛋白质和RNA。研究表明尿液中也含有外泌体。

尿液外泌体研究中的一个难点是尿液中外泌体的提取与分离。在目前存在的分离外泌体的分离方法主要有以下几种:

第一种方法是利用不同的超速离心速度(Théry C et al.Curr Protoc CellBiol,2006；3:1–29)或者是密度梯度离心(Tauro BJ et al.Methods 2012；56:293–304.)，这种方法被认为是外泌体分离的金标准，用此方法分离的外泌体的纯度高，但此方法需要配有价格不菲的超高速离心机和耗材，且可能破坏外泌体结构(Linares R et al.JExtracell Vesicles 2015；4:29509)。

第二种方法是超滤法(Merchant ML et al.Proteomics-Clin Appl2010；4:84–96)，此方法虽然操作简单。但是得到的外泌体的纯度不高(Danqi Wang and Wei Sun,Proteomics,2014；14,1922-1932)。

第三种方法是商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀(Lobb RJ et al.J Extracell Vesicles2015；4:27031)，但这类方法面临的不足是提取的外泌体纯度不够且试剂盒价格昂贵。另一类方法是将样品加入到柱子中(Bo AN et al.J Extracell Vesicles2014；3:23430)，在通过柱子的过程中，样品中的蛋白质等杂质会进入到柱子中，而粒径较大的外泌体会先从柱子中流出，这样能较快速的得到纯度较高的外泌体。但成本过高限制了这种方法的应用。

第四种方法是利用价格便宜的聚乙二醇将外泌体沉淀下来(Rider MA et al.SciRep 2016；6:23978)，此种方法和商品化的外泌体提取试剂盒原理相类，其优点在于提取成本不高，缺点是提取的外泌体的纯度不高。

因此，目前缺少一个具有成本低、操作简单、产率和纯度高且外泌体结构完整等优点的尿液外泌体分离方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是建立一种分离高纯度尿液外泌体的方法，具有成本低、操作简单、产率和纯度高且外泌体结构完整等优点。为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案，包括以下步骤：

步骤一、尿液样品离心，弃沉淀，收集上清液；

步骤二、将步骤一得到的上清液用滤头过滤，收集过滤液；

步骤三、将步骤二得到的过滤液装入透析袋中透析得到外泌体；

步骤四、将步骤三中获得的外泌体在超滤管中超滤最终得到浓缩的尿液外泌体。

进一步地，步骤一中的尿液样品是新鲜尿液、-20℃冷冻保存过的尿液和/或-80℃冷冻保存过的尿液。

进一步地，步骤一中离心的时间为5min，转速是3000rpm。