[发明专利]一种用于造血干细胞培养的滋养层的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于造血干细胞的滋养层的制备方法。

背景技术

脐带血被认为是一种除了骨髓移植以外治疗血液系统疾病，尤其是血液系统肿瘤的重要资源。从1988年第一例临床成功移植脐带血以来，其应用随着细胞治疗研究的发展得到的了长足的进步。虽然相比骨髓和外周血，脐带血在造血重建中的应用比例仍然处于相对较低的水平，到目前为止，超过25000例脐带血成功移植的案例仍使人们对这一曾被丢弃的宝贵资源充满了信心。作为造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell，HSC)的来源，脐带血对比骨髓和外周血有两个天然的优势，首先，脐带血移植的移植物抗宿主病(GVHD)风险远远小于其他两者，这对异体移植的成功有重要意义；其次，脐带血移植时的HLA配型要求很低，大大的降低了患者获取可用细胞源的难度。尽管如此，脐带血想要替代骨髓成为HSC最主要的来源并非易事，其中有两个问题是制约脐带血造血干细胞的主要原因，即数量不足和植入时间长。为了克服脐带血的这些不足之处，研究人员尝试了许多不同的方法，其中分离并体外扩增脐带血造血干细胞是目前被认为最有临床前景的手段。

间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，可以以其作为滋养层培养造血干细胞。但是，采用MSC作为滋养层培养造血干细胞时，MSC会大量增殖，并在培养一段时间后会大量脱落凋亡，产生的大量溶酶体等物质，并改变培养基pH值环境，极大的影响造血干细胞的扩增，并引起凋亡。有文献报道用丝裂霉素处理MSC细胞可以阻止其增殖，但残留的丝裂霉素会对将要扩增的造血干祖细胞造成非常不利的影响。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种新的用于造血干细胞的滋养层的制备方法。

本发明用于造血干细胞的滋养层的制备方法，步骤如下：

(1)取细胞培养板，包被胶原蛋白，得包被了胶原蛋白的细胞培养板；

(2)取间充质干细胞的细胞悬液，接种到步骤(1)中包被了胶原蛋白的细胞培养板中，培养至细胞融合度为70-90％时，即可。

步骤(1)中，所述胶原蛋白是鼠尾胶原蛋白。

步骤(1)中，每孔包被0.8-1.2ml胶原蛋白，优选为1ml胶原蛋白。

步骤(2)中，接种的间充质干细胞悬液的浓度为1×10⁵～1.5×10⁵个细胞/孔。

步骤(2)中，培养采用的培养基为用于造血干细胞培养的无血清培养基。

其中，所述无血清培养基培养为SFEM无血清培养基。

SFEM无血清培养基，购自stem cell公司。

本发明还提供了前述方法制备得到的滋养层。

本发明还提供了前述滋养层在培养造血干细胞中的用途。

本发明造血干细胞的培养方法，它是以前述滋养层为滋养层进行培养。

优选地，所述培养方法的步骤如下：取前述的滋养层，接种造血干细胞，加入无血清培养基，培养即可；所述无血清培养基是每1ml添加有50-100ngSCF、25-50ng TPO、10-50ng Flt-3L的SFEM无血清培养基。

本发明方法制备的滋养层，能够为造血祖干细胞(HSPC)的体外扩增提供有力的支持作用，显著提高HSPC的扩增效率，能够极大程度的缓解HSPC不足的问题，应用前景良好。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1本发明制备的MSC滋养层细胞增殖和细胞形态情况

图2本发明制备的MSC滋养层细胞在共培养12天后的存活率情况

图3本发明制备的MSC滋养层共培养的造血干祖细胞在扩增12天后的情况

具体实施方式

主要仪器及试剂：

SFEM 无血清培养基，购自stem cell公司货号09650；

造血干细胞培养基：SFEM无血清培养基，购自stem cell公司；

SCF 干细胞生长因子

TPO 促血小板生成素

FLT-3 配体 FMS样酪氨酸激酶配体

以上三种细胞因子购自Peprotech公司；

胰酶，购自gbico公司；