[发明专利]一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用。

背景技术

烟碱俗称尼古丁(Nicotine)，是普通烟草中的生物碱，也是烟草的重要成分，其作用主要在于它所产生的生理强度，即通常所说的劲头，该强度与烟碱含量成正比。烟碱会使人上瘾或产生依赖性，影响人们的健康。有报道指出，烟碱不仅会增加心脏速度和升高血压，也会导致血管内皮功能障碍。2000年，全球大约有490万例与吸烟相关的猝死病例发生。吸烟引发了至少30％的癌症死亡和87％的肺癌死亡。因此，烟草中烟碱含量过高会严重危害烟民的健康，可通过降低烟碱含量来减少吸烟引发的疾病。

虽然目前已有一些降低烟草中烟碱含量的方法，如浸提法和农业措施，但这些技术在降低烟碱的同时，也会对香烟的品质产生影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种降低烟叶烟碱含量、提高烟叶可用性、用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株及其分离鉴定方法和应用。

发明人在研究发现，一些微生物可以降解烟碱，如嗜烟碱节杆菌、假单胞杆菌属、无色杆菌、石膏样小孢子菌、球形节杆菌等。这些微生物可以通过不同的代谢途径来降解烟碱，也可以分解烟叶中的烟碱但不会影响香烟的主要品质。

本发明的目的通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株，菌株代号为ND9，该菌株于2016年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.13055。菌株是从中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田土样中获得。

本发明还提供了所述的用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法，包括以下步骤：

S1、样品采集：土样采自中国农业科学院烟草研究所试验农场的烟田，将采集的土样在室温下自然风干，然后用研钵将风干的土样研碎，备用。

S2、配制培养基：

富集培养基：13.3g K₂HPO₄·3H₂O，4g KH₂PO₄，0.2g MgSO₄·7H₂O，0.5mL微量元素溶液，定容至1L，pH7.0。121℃高压蒸汽灭菌20min后，烟碱用0.22μm滤膜过滤菌后根据需要加入，4℃保存。

分离培养基：富集培养基中添加质量百分比为1.5％琼脂。

筛选培养基：改变分离培养基中烟碱浓度。

LB固体培养基：25gLB肉汤，18g琼脂粉，定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。

微量元素溶液：0.05g CaCl₂·2H₂O、0.05g CuCl₂·2H₂O、0.008g MnSO₄·H₂O、0.004g FeSO₄·7H₂O、0.1g ZnSO₄和0.1g Na₂MoO₄·2H₂O，用0.1mol/L HCL溶解定容至1L。

S3、降解菌的分离、纯化：将2g烟田土样加入到100mL(烟碱含量为0.5g/L)富集培养基的三角瓶中，28℃、150rpm富集培养4天，然后取10mL培养物转接至另一100mL(烟碱含量为0.5g/L)富集培养基中培养4天，达到富集的目的，再接入筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)，重复3次。通过平板稀释法将培养物涂布于LB固体培养基上，28℃下培养48h。经富集分离，筛选到能够耐受烟碱的细菌，代号为ND9。将分离得到的菌株先接种到固体筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)上，后接种到液体筛选培养基(烟碱含量为1.0g/L)上进行纯化，4℃保存。

所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的分离方法包括恶臭假单胞菌菌株的鉴定步骤。

所述的一种用于烟碱降解的恶臭假单胞菌菌株的鉴定方法，包括以下步骤：