[发明专利]甘蓝型油菜开花期基因BnFLC.A2和Bnflc.a2的克隆及应用

说明书

甘蓝型油菜开花期基因BnFLC.A2和Bnflc.a2的克隆及应用，本发明提供了一种油菜早花基因Bnflc.a2以及晚花等位基因BnFLC.A2的两条DNA片断的分离克隆、功能验证及应用。早花隐性基因Bnflc.a2是BnFLC.A2基因的功能丧失突变体。本发明开发早花基因的功能标记，通过甘蓝型油菜495份自然群体基因型及花期表型分析发现，Bnflc.a2基因在自然群体中对开花期的影响在七个环境下均表现出显著水平，说明Bnflc.a2中的长片段插入导致该拷贝功能丧失是影响甘蓝型油菜开花时间自然变异的重要因素。利用该基因本身的序列设计功能标记进行分子标记辅助选择选育早花材料进而培育出早花、早熟油菜，具有准确、高效、经济的特点。

技术领域

本发明属于油菜分子育种技术领域，具体涉及包含甘蓝型油菜早花基因Bnflc.a2及其晚花等位基因BnFLC.A2的两条DNA片断的分离克隆、功能验证及应用。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是一种异源四倍体作物，约7500年前由二倍体作物白菜(B.rapa)和甘蓝(B.oleracea)的自然杂交并通过天然加倍而形成(Chalhoub etal 2014)。甘蓝型油菜(B.napus)是一种重要的油料作物，在我国广泛种植。适时开花不仅影响着甘蓝型油菜的产量和品质，也决定了其对生态区域的适应性，因此开花期是甘蓝型油菜育种的重要目标性状之一。根据甘蓝型油菜的春化需求划分为冬性油菜、半冬性油菜和春性油菜，其中半冬性油菜主要分布在我国的长江流域，而春性油菜则主要分布于甘肃，青海，内蒙等省。目前，在实际生产中甘蓝型油菜和水稻、棉花等作物茬口矛盾突出，导致甘蓝型油菜种植面积大幅度下降，菜籽油的自给率严重不足。解决这一问题的关键就是缩短甘蓝型油菜的生育期，开展甘蓝型油菜早熟育种。前人研究表明甘蓝型油菜早花和早熟呈现出显著正相关，通过早花材料的选择可以选育出早熟油菜(Campbell and Kondra 1978；高永同1979；刘后利1985；Amiri-Oghan et al 2009)。因此，调控甘蓝型油菜适时开花，除了对其产量和品质具有重要意义之外还能够避免甘蓝型油菜同稻、棉争地的现状。

目前，甘蓝型油菜开花期研究仍集中在开花期QTL的定位工作上，成功通过图位克隆技术克隆甘蓝型油菜开花期基因的报道还很少。Ferreira等(1995)在很早就利用冬油菜Major和春油菜Stellar构建了DH群体，进行了在春化处理条件下和没有春化处理情况下的花期QTL的定位。他们共检测到3个QTL位点，其中位于LG9(N2连锁群)上的QTL位点在不春化、春化处理4周以及春化处理8周这三种条件下均和该群体花期显著相关；其中春化处理8周条件下，该位点可以解释表型变异的28％。Butruille等(1999)利用德国冬油菜栽培品种Ceres和澳大利亚春油菜品种Marno以及加拿大春油菜品种Westar构建了多个IBLs群体，他们用这些IBLs群体检测到多个与花期显著相关的位点，其中位于N2连锁群上的一个QTL位点可以解释表型变异的22.6％，该位点和Ferreira等人检测到的位于LG9上的花期QTL位点在同一个区间；此外，他们还检测到一个位于N12连锁群上的主效花期位点，该位点可以解释表型变异的26％。Raman等(2016)通过搜集182份甘蓝型油菜品种，在三种不同的环境下(大田环境、温室以及人工控制的环境)记录花期表型然后进行关联分析，他们共发现69个SNPs位点和花期表型显著相关，而且这些位点可以重复的检测到。

发明内容

本发明人首次通过图位克隆技术成功克隆了甘蓝型油菜开花基因BnFLC.A2，而且通过比较测序，遗传互补实验以及表达实验证实了BnFLC.A2是一种甘蓝型油菜晚花基因。

此外，通过双亲比较测序，发明人在甘蓝型油菜中第一次发现了一个包含约2.8kb长片段插入的Bnflc.a2基因。通过Bnflc.a2基因的序列分析及表达分析证实该基因是一个功能缺失型突变。该基因的功能丧失导致了开花时间提早。通过自然群体分析表明Bnflc.a2中的长片段插入导致该拷贝功能丧失是影响甘蓝型油菜开花时间自然变异的重要因素，说明该基因具有重要的应用价值。