[发明专利]肝素结合蛋白测定试剂盒

权利要求书

1.一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括：酶标包被板、样本稀释液、洗涤缓冲液、终止液、酶结合物、底物、校准品、质控品；

该试剂盒采用双抗体夹心法，酶标包被板的微孔内包被了HBP单克隆抗体，在初次孵育期间，利用样本稀释液稀释血浆中的HBP作为抗原物质与固相上包被的HBP单克隆抗体结合，形成固相抗体抗原复合物；

利用洗涤缓冲液充分洗涤以除去未结合的成分，加入酶结合物孵育，酶结合物与固相抗体抗原复合物结合；

进一步洗涤，除去未结合的成分，再加入底物孵育，底物被酶催化成为有色产物，再加入终止液以终止反应，通过酶标仪检测各孔光密度值；光密度值的大小与血浆中HBP浓度成正相关。

2.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述酶结合物为酶标记的HBP单克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述样本稀释液由25mmol/L DTT、100mmol/L pH8.0的Tris缓冲液、2mmol/L pH8.0的EDTA和 200mmol/L NaCl组成。

4.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述洗涤缓冲液包含：20mmol/L磷酸二氢钾、20mmol/L磷酸氢二钠、20mmol/L氯化钠、20mmol/L氯化钾溶液和2mol/L NaCl，pH7.4。

5.根据权利要求1所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于：所述终止液为硫酸，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺。

6.利用权利要求1所述试剂盒测定肝素结合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）准备工作：将酶标包被板及试剂盒中其他组分在18-25℃平衡约30min，各试剂使用前充分摇匀，将试剂盒中的洗涤缓冲液25mL使用纯化225mL10倍稀释待用；稀释质控品及样本：用样本稀释液390μL按1:40 稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本10μL，充分混匀；

（2）加样：加100μL校准品1-6、预稀释低值质控品、中值质控品、高值质控品及样本至相应的孔中，各做两个重复；

（3）孵育：18-25℃条件下，孵育60 min；

（4）洗涤：快速翻转酶标包被板，轻轻倒出反应孔中的溶液，将酶标包被板在吸水纸上倒扣拍干，每孔至少加入300 μL洗涤缓冲液冲洗反应孔，轻轻倒出反应孔中的溶液，倒置于吸水纸上拍干，使反应孔内无肉眼可见的液体和气泡。按上述操作，重复洗涤3次；

（5）加酶结合物：每孔加100μL的酶结合物，18-25℃条件下，孵育60 min；

（6）洗涤：同步骤（5）；

（7）显色：每孔加100μL底物，18-25℃条件下，孵育10 min；

（8）终止反应：每孔加100μL终止液，轻摇酶标板混匀，确保无肉眼可见的气泡，终止反应；

（9）读取吸光度值：酶标仪下450nm下读取光密度值；

（10）计算结果：以校准品1-6 的平均光密度值为纵坐标，以校准品的浓度值为横坐标，使用酶标仪系统软件绘图，使用线性回归拟合绘制校准曲线通过样本光密度值，即可在校准曲线上找到其所对应的样本浓度值。

7.根据权利要求6所述的测定肝素结合蛋白的方法，其特征在于：所述样本稀释液由25mmol/L DTT、100mmol/L pH8.0的Tris缓冲液、2mmol/L pH8.0的EDTA和 200mmol/L NaCl组成。

8.根据权利要求6所述的测定肝素结合蛋白的方法，其特征在于：所述洗涤缓冲液包含：20mmol/L磷酸二氢钾、20mmol/L磷酸氢二钠、20mmol/L氯化钠、20mmol/L氯化钾溶液和2mol/L NaCl，pH7.4。

9.根据权利要求6所述的测定肝素结合蛋白的方法，其特征在于：所述终止液为硫酸，所述底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所述酶结合物为酶标记的HBP单克隆抗体。