[发明专利]用于检测万古霉素耐性基因LAMP引物组合及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，用于检测万古霉素耐性基因LAMP引物组合及其应用。

背景技术

抗菌药物是临床应用最广泛的一类药物，但近年感染性疾病的病死率迅速提升，究其原因在于抗生素滥用，耐药菌带来的用药困难。我国是抗生素滥用情况最为严重的国家之一，然而随着抗生素使用量的加大，细菌耐药情况也越发严重。

抗生素种类繁多，作用机制多样，其中万古霉素(vancomycin)为一种三环的糖肽类抗生素，对多种革兰氏阳性菌均具有强大的抗菌作用，包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌及肠球菌属等。它的抗菌机理为与直接与细胞壁肽聚糖前体五肽侧链末端D-丙氨酰-D-丙氨酸结合，从而阻止肽聚糖多聚酶的转肽作用，干扰细菌细胞壁肽聚糖前体的交叉联结，从而使细菌细胞壁不能形成三维空间结构而发挥杀菌效果；同时也可具有一定损伤细菌细胞膜和抑制细菌RNA合成的作用，也可对抑菌发挥一定功能。

细菌产生耐药性的原因很多，主要分为产生灭活酶、抗菌药物作用靶位改变、改变细菌外膜通透性、影响主动泵出系统、影响细菌被膜的形成及交叉耐药性等六方面。

目前大量耐药监测数据显示万古霉素仍保持较好的抗菌活性，但针对其耐药现象也日益严重。自20世纪80年代以来，耐万古霉素的肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌已在临床出现，并有缓慢增多趋势，且近年来某些地区已分离到对万古霉素等糖肽类敏感性下降的金黄色葡萄球菌，已引起临床重视。

对万古霉素的耐药方式分为获得性耐药和先天性耐药，是由万古霉素耐药基因编码的酶的存在合成低亲和力的前体，其中C-端的D-丙氨酸残基被D-乳酸或D-丝氨酸取代，从而改变万古霉素的作用位点，消除由诉诸产生的具有高亲和力的前体，从而消除了与万古霉素结合的靶位，导致针对万古霉素耐药的发生。

目前关于对细菌耐药性的检测主要有以下几种方法：细菌耐药表型的检测(包括耐药筛选试验、折点敏感试验及药敏试验的仪器化和自动化等)，β-内酰胺酶检测，特殊耐药菌检测和耐药基因检测等。其中最为直观的检测方法是以体外培养的药物检测，但仍存在培养时间长等缺陷。随着耐药机理的研究逐步深入，分子生物学方法检测细菌耐药逐渐被临床接受。常见检测细菌耐药基因的方法主要有：聚合酶链式反应(PCR)、PCR-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、PCR-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、生物芯片技术(gene chip)、自动DNA测序(DNA sequencing)等。传统的基因鉴定方法为PCR法和DNA测序法，其中传统的PCR法检测周期较长，通常需要3-4个小时；SangerDNA测序法对引物特异性要求较高，且价格较昂贵，后期数据分析较复杂，不适合临床推广使用。近年新发展起来的核酸等温扩增技术，无论是在反应时间还是仪器要求方面，都比PCR技术更有优势。在这些众多等温扩增技术中，又以环介导等温扩增(LAMP)的应用最为成熟、最为广泛，其高灵敏度、高特异性、快速的扩增得到了市场的检验和认可。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测万古霉素的耐药基因LAMP引物组合及其应用。

本发明首先提供了一种引物组合，为如下(a1)或(a2)：

(a1)由引物组Ⅰ和引物组Ⅱ组成；

(a2)所述引物组Ⅰ或所述引物组Ⅱ；

所述引物组Ⅰ由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB组成；

所述引物Ⅰ-F3为如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(b2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3为如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(b4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-FIP为如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；

(b6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-BIP为如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；

(b8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；