[发明专利]一种人体血清中α‑酮戊二酸的直接定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体地说，是一种人体血清中重要的小分子生物标志物α-酮戊二酸的直接定量检测试剂盒。

背景技术

α-酮戊二酸(α-Ketoglutaric acid，简称α-KA，CAS：328-50-7)是一种重要的生物化合物，其通常存在的形式是它的阴离子，即α-酮戊二酸盐(α-ketoglutarate，简称α-KG)。α-酮戊二酸是三羧酸循环中的一个关键物质，在循环中的位置位于异柠檬酸之后以及琥珀酰辅酶A之前。氨基酸的氨基通过转氨基作用被结合到α-酮戊二酸之上，并随着血液载到肝脏，在肝脏中氨进入尿素循环，所以α-酮戊二酸广泛存在于人体血清中。已有的研究结果表明，血液中的α-酮戊二酸浓度变化与众多疾病密切相关，例如非酒精性脂肪肝和急性髓细胞白血病等，因此检测血清中α-酮戊二酸的浓度变化具有着重要的临床诊断意义(Weihai He,et al.,Nature,2004,429,188-193；E Rodriguez-Gallego et al.,Int.J.Obesity.,2015,39,279-287；Perl,A.E.et al.,Blood,2012,121,4917-4924)。

众所周知，肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。统计结果表明，每年约30万人因肝硬化死亡，其发病率高居第4位，仅次于恶性肿瘤、心血管病、脑血管病。肝癌更是一种对人体危害很大的疾病，也是所有癌症中死亡率、死亡速度最快的恶性肿瘤之一。我国一直是肝癌的高发区，由于初期症状不明显，病情进展快，肿瘤恶性程度高，易复发而导致肝癌患者预后差，其五年生存率很低。早发现、早诊断、早治疗，仍然是改善肿瘤预后的最好办法。

传统检测血清中α-酮戊二酸浓度的方法是色谱联用检测法和核磁共振法。但由于α-酮戊二酸的分子量较小，难以直接应用色谱联用检测法对其进行定量检测，需要对血清进行复杂的预处理，比如对α-酮戊二酸进行芳环加成衍生反应预处理，其操作过程不仅繁琐、费时，且易产生干扰副产物导致测试误差大，灵敏度差。虽然核磁共振方法适合于临床无创检测，但其仪器昂贵，检测成本较高，耗费时间较久，难以实现定量检测。目前，已有利用荧光法检测水溶液中α-酮戊二酸浓度变化的报道，但由于其无法直接应用于血清中检测α-酮戊二酸，且存在特异性差、响应速度慢等缺陷，极大地限制了其在体外原位诊断中的应用(Pengwei Jin,et al.,Chem.Sci.,2014,5,4012-4016)。同时，由于α-酮戊二酸在人体中的广泛存在，市面上已经有专门用于定量或半定量检测α-酮戊二酸的α-酮戊二酸的试剂盒，例如效果较好的分别是Biovision和Sigma-Aldrich公司的α-酮戊二酸试剂盒。其中Biovision公司的α-酮戊二酸试剂盒的检测量程为0.01-10nmol(http://www.amyjet.com/products/K677-100.shtml)。Sigma-Aldrich公司的α-酮戊二酸试剂盒的检测灵敏度为0.01-10nmol(http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search？term＝MAK054&interface＝All_ZH&N＝0&mode＝match％20partialmax&lang＝zh&region＝CN&focus＝product)。但是这些试剂盒价格昂贵，每测量1次需要花费40到60元不等，测试前需要较为复杂的预处理，并且会存在很多测试不精确的问题。数据表明目前市面上的试剂盒不能直接用于检测血清中的α-酮戊二酸，且价格高昂，成本太高，测试不精确。

因此，亟需发展一种具有简单快速高效原位直接检测人体血清中α-酮戊二酸浓度的试剂盒，期望其能应用于相关疾病(如肝硬化、肝癌)的临床诊断中，为早期、快速诊断提供可靠的重要依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人体血清中α-酮戊二酸的直接定量检测试剂盒，旨在克服现有技术中如无法直接测量、检测方法繁琐、成本高昂等不足，从而极大地拓展其在临床诊断中的应用。应用本发明中的试剂盒对人体血清标本(73例)进行检测，结果表明相比于正常人，肝硬化和肝癌病患血液中α-酮戊二酸的浓度数值显著偏高，因此在肝硬化和肝癌的临床诊断中，准确测量人体血液中的α-酮戊二酸浓度变化可以作为早期临床诊断的重要依据。