[发明专利]一种增强植株抗虫性的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物表皮细胞发育技术领域，尤其涉及一种增强植株抗虫性的方法。

背景技术

表皮毛由植物表皮细胞发育而来，广泛分布于陆生植物，是生长在植物表皮组织的一种特化结构。研究表明，植物表皮毛可以减少植食性昆虫、紫外线照射以及过度的蒸腾作用对植物的伤害，因此，在增强植物抗逆性方面扮演了重要角色。植物中的表皮毛可以分为分泌型表皮毛和非分泌型表皮毛两种，可以在逆境条件下为植物提供物理和化学屏障。

综上所述，现在虫害很严重，化学农药害处大，增加了害虫的抗药性，降低了食品安全性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强植株抗虫性的方法，旨在解决现在虫害很严重，化学农药害处大，增加了害虫的抗药性，降低了食品安全性的问题。

本发明是这样实现的，一种增强植株抗虫性的方法，所述增强植株抗虫性的方法包括以下步骤：

步骤一，番茄基因序列Solyc11g069190.1的克隆；

步骤二，含番茄基因序列Solyc11g069190.1的载体构建及其功能鉴定；

步骤三，超量表达载体pLP35S-SlARF4转化番茄；

步骤四，转基因株系的鉴定，获得转基因植株。

进一步，所述番茄基因序列Solyc11g069190.1的克隆具体包括：

(1)番茄果实RNA的提取，准备1.5ml离心管，加入450ulLysis Solution PL；分别用液氮迅速研磨番茄果肉组织，研磨至均一细小的粉末，转移至第一步准备好的离心管中，涡旋混合均匀；室温下最大转速离心1min；将蓝色的柱子置于2ml的收集管中，将离心得到的上清液转移到柱子中，在室温12000rpm条件下离心2min；配制70％乙醇溶液，向滤液中加入等体积的乙醇溶液，并且振荡混合均匀；将红色柱子置于收集管中，将得到的滤液转移到柱子中，在室温12000rpm条件下离心2min。弃去滤液和收集管，更换新的收集管；向红色柱子中加入500ul Washing Solution HS，合上盖子。在10000g的条件下离心1min。弃去滤液和收集管，更换新的收集管；向红色柱子中加入650ul Washing Solution LS，合上盖子；在10000g的条件下离心1min；弃去滤液和收集管，更换新的收集管；在室温12000rpm条件下离心2min；弃去收集管，将红色柱子取出置于1.5ml离心管中，加入50ulRnase-free水，室温静置至少1min后，在8000rpm的条件下离心1min；

(2)番茄果实RNA反转录成cDNA，将试剂Total RNA2ug、Oligo(dT)18primer 1ul、Water，nuclease-free to12ul，总体积12ul加入已灭菌无Rnase的离心管中；将离心管中的试剂轻轻混匀，快速离心，置于65℃放置5min，在冰上冷却；将试剂5×Reaction Buffer 4ul、Ribolock RNase Inhibitor 1ul、10mM dNTP Mix2ul、RevertAid M-MuLV RT 1ul加入反应体系中；混匀并且快速离心；置于42℃放置60min；在70℃放置5min终止反应。

进一步，所述含番茄基因序列Solyc11g069190.1的载体构建及其功能鉴定包括：

(1)根据序列表Solyc11g069190.1序列设计正向引物5′AACCCGGGATGGAAATTGATCTGAATCA3′和反向引物5′AACCCGGGAATCCTGATTACAGTTGGAG′，其中下划线核酸分别是SmaI酶切位点，扩增基因片段大小约2400bp；

将扩增获得的PCR片段和植物表达载体PLP10035S分别用SmaI酶切，酶切条件如下：PCR产物或真核表达载体：200ng、SmaI 1ul、10X FD Buffer 2ul，加ddH₂O至20μl，37℃酶切30min；

(2)用凝胶回收试剂盒分别回收上述酶切片段；

(3)将回收的基因片段用T4连接酶进行连接，反应条件如下：

PCR酶切回收片段：10ng

pLP10035S载体片段：60ng

5X T4buffer：2ul

T4连接酶：100U

加ddH₂O至终体积：10μl

22℃连接20分钟；