[发明专利]一种以牛大力花药为外植体的再生方法

说明书

本发明属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为外植体的再生方法，是以牛大力花药为材料经愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖，将增殖后的胚性愈伤组织诱导形成胚状体，再由胚状体诱导发育形成小植株，最后将小植株进行壮苗培养形成正常植株。本发明以牛大力花药为外植体，通过愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导、胚发育和胚萌发成苗的过程，建立了一种牛大力的再生体系，并创建了子叶型胚的二次诱导体系，能长期提供胚性愈伤组织，可为牛大力诱变育种、转基因育种以及牛大力的产业化发展提供技术支持。

技术领域

本发明属植物组培技术领域，涉及一种以牛大力花药为材料的再生方法，具体是一种利用牛大力花药诱导分化胚性愈伤组织后，再诱导胚状体萌发，萌发的胚状体发育为植株的组织培养方法。

背景技术

牛大力(Callerya speciosa)，学名美丽鸡血藤，又名猪脚笠、金钟根、山莲藕、倒吊金钟、大力薯，为豆科(Leguminosae)鸡血藤属(Callerya)植物。牛大力是一种药食两用植物，我国野生分布在广东、广西、云南、福建和海南等地，《本草纲目》记载，牛大力具有健脾润肺、养肾补虚、舒筋活络之功效，适用于肾虚，血气不旺，风湿骨痛，经常咳嗽患有急慢性支气管炎及吸烟人士。国内南方各省，包括香港，民间有时常用牛大力泡酒、煲汤的饮食习惯，能强身健体，增强体质，提高抗病力。随着市场需求量的不断增加，野生资源已经接近枯竭，人工种植已成为牛大力产业化发展的有效途径,如何获取牛大力优良新品种已成为亟待解决的问题。

长期以来牛大力一直处于野生状态，优良新品种稀缺，从杂合度很高的牛大力野生资源中获得纯化株系，需要很长时间的自交过程，严重影响了产业的发展。因此，通过组织培养技术培育牛大力优良无性系是获得牛大力新品(系)种的有效途径。经检索尚未见以牛大力花药为外植体进行再生的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种以牛大力花药为外植体的再生方法，利用牛大力花药进行培养并再生，可以在短时间内纯化牛大力种质，为不同种质间杂交育种提供材料。

本发明所采用的技术方案：

一种以牛大力花药为外植体的再生方法，包括牛大力花药获取、愈伤组织诱导、胚性愈伤组织诱导及增殖、胚状体诱导及发育和萌发成苗的过程，其具体步骤如下：

1、外植体获取

在牛大力盛花期，选取花瓣即将露出花萼或露出花萼1mm以内的花蕾，用0.1％HgCl₂消毒10min后，无菌水冲洗4次，吸干水分后取花药；或75％酒精喷雾，于超净工作台吹干后取花药；或直接依次剥掉花萼和部分花瓣，用尖头镊子小心的取花药。污染率低于5％，存活率(不变黑或不变白者)90％以上。

2、愈伤组织及胚性愈伤组织诱导

将获取的牛大力花药接种在愈伤组织培养基上，培养温度24～26℃，暗培养。培养25天时，肉眼可见花药分化出少量愈伤组织；继续培养，60天后，部分愈伤组织形成胚性愈伤组织。所述愈伤组织培养基是以改良的MS为基本培养基，并添加2,4-D 3.5mg/L以下、6-BA 0.2～2.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。

3、胚性愈伤组织增殖诱导