[发明专利]一种表达人α1‑抗胰蛋白酶的重组细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种表达人α1-抗胰蛋白酶的重组细胞株及其应用。

背景技术

人α₁-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)是一种世界范围的遗传疾病，为单基因突变导致的常染色体共显性遗传，主要表现为肺气肿、肝硬化、肝癌，少数体现为皮肤疾病脂膜炎等。AATD患者的治疗需要依赖周期性静脉注射人α₁-抗胰蛋白酶制剂。

目前，临床使用的人α₁-抗胰蛋白酶制剂主要由人血浆纯化获得，这限制了其大批量生产，导致了人α₁-抗胰蛋白酶制剂供不应求，价格昂贵，仅有部分患者有条件使用。除此之外，由于诊断技术的限制，多数的AATD患者至今未得到有效诊断，所以随着诊断技术的进步，人α₁-抗胰蛋白酶制剂的需求势必将进一步增加。然而，人血浆资源供应有限，制约着血浆纯化来源的人α₁-抗胰蛋白酶制剂的供应，亟需开发重组人α₁-抗胰蛋白酶制品。目前，世界上尚无药用的重组人α₁-抗胰蛋白酶制品产生。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种表达人α1-抗胰蛋白酶的重组细胞株。

本发明的另一个目的是提供一种表达人α1-抗胰蛋白酶的重组细胞株的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种表达人α1-抗胰蛋白酶的重组体细胞株的构建方法，包括如下步骤：

(1)获得含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列、AAVS1位点左、右同源臂序列的表达质粒，表达质粒中所述人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列在所述AAVS1位点的左、右同源臂之间；在表达质粒中筛选标记基因的两侧分别插入一个LoxP序列，且这两个LoxP序列的方向一致，得到改造的表达人α1-抗胰蛋白酶的重组质粒；

(2)将步骤(1)改造的表达人α1-抗胰蛋白酶的重组质粒和靶向AAVS1位点的CRISPR/Cas9质粒共转染人的体细胞，筛选获得定点整合的体细胞；

(3)以表达Cre酶的质粒转染步骤(2)获得的定点整合的体细胞，通过Cre/LoxP系统切除筛选标记，筛选获得切除了筛选标记且稳定表达重组α₁-抗胰蛋白酶的体细胞株。

本发明的细胞株是通过CRISPR/Cas9基因编辑技术结合同源重组实现的。其中CRISPR/Cas9的靶序列在人的基因组AAVS1位点，靶序列为GGGGCCACTAGGGACAGGAT。当CRISPR/Cas9质粒和改造后的表达载体共转染体细胞后，CRISPR/Cas9系统在靶位点处剪切DNA，形成双链缺口。在存在含有同源臂的目的基因载体的情况下，双链缺口以其为模板，进行同源重组修复，实现目的基因在靶点处的定点插入。

在本发明中，人基因组的AAVS1位点位于人19号染色体的PPP1R12C基因的内含子中；所述人α1-抗胰蛋白酶具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，人α1-抗胰蛋白酶的基因具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

步骤(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列、AAVS1位点左、右同源臂序列的表达质粒，可以通过克隆技术进行构建，也可以直接采用商业化的产品质粒。优选地，步骤(1)所述含人α1-抗胰蛋白酶基因序列、筛选标记基因序列、AAVS1位点左、右同源臂序列的表达质粒为Genome-TALER^TM货号为DC-DON-SH01的AAVS1供体克隆载体。

优选地，所述LoxP序列如SEQ ID NO:4所示。

AAVS1位点在所有的人细胞中存在，所以所有类型的人细胞都可以通过该方法进行基因编辑，只是蛋白表达量可能有所不同。优选地，选择已经商业化生产的人的体细胞作为受体细胞，更便于工业生产，最优选地，所述人的体细胞为HEK293细胞或PER.C6细胞。尤其是HEK293细胞，其表达目的蛋白的量特别好，另外，该细胞株表达的人α1-抗胰蛋白酶的结构和功能更类似于天然的α1-抗胰蛋白酶，更有利于人α1-抗胰蛋白酶制剂的推广和应用。

优选地，本发明提供的重组细胞株的制备方法中，步骤(1)中的所述筛选标记基因由荧光报告基因和抗药性基因组成。在本发明的一些实施方式中所述筛选标记基因中的荧光报告基因为GFP基因，抗药性基因为抗嘌呤霉素基因。