[发明专利]茶多酚与壳聚糖配伍用于制备猪精液保存用稀释液的应用

说明书

本发明涉及茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液保存用稀释液的应用。本发明的猪精液常温保存的抗氧化剂，由于采用了茶多酚与壳聚糖配伍作为抗氧化剂，两者之间存在依赖性的协同关系，适当浓度的茶多酚与壳聚糖配伍才能够在猪精液常温保存过程中很好地保护猪精子的生理活性。

技术领域

本发明涉及用于制备猪精液常温保存的茶多酚与壳聚糖配伍稀释液配方及其最佳配伍浓度，可有效提高精液保存效果，并能有效降低精液中细菌的含量，提高精液中抗氧化酶的活性。

背景技术

猪精液的常温保存有效的延长了精子的体外保存时间，切实提高良种公猪的种用价值，降低生殖系统疾病的发生，促进猪人工授精技术的发展和应用。由于常温保存稀释粉配方是决定猪精液常温保存效果的关键，而目前国内猪精液常温保存稀释粉配方仍无法完全打破国外的垄断，因而猪精液的常温保存需要更加高效稳定的稀释粉。但是，稀释粉配方中所用保护剂的种类及用量是决定精液稀释后保存效果的核心，且与其他成分的比例及配伍将直接关系到保存后精子的生理状态和活性。

活性氧(ROS)是细胞需氧代谢过程中产生的不稳定代谢产物(任俊玲等2013)。哺乳动物精液本身存在一定的ROS防御系统(Awda et al.2009)，主要为酶类抗氧化系统，包括SOD、CAT和GSH-PX。虽然不同物种间的抗氧化酶活性不尽相同(Strzezek et al.2002)，但对于同一动物而言，SOD活性能反映整个系统抗氧化酶的水平，SOD活性越高，抗氧化能力越强。虽然CAT和GSH-PX在SOD清除自由基的过程中发挥协助作用，但CAT和GSH-PX活性也从侧面反映该系统的抗氧化水平(Orzolek et al.2013)。因此，实验室检测细胞代谢系统中抗氧化水平通常采用SOD、CAT和GSH-PX试剂盒检测其活性。H₂O₂是氧自由基的一种，过量的H₂O₂会对细胞造成损伤。对于精子细胞而言，会破坏精子的受精能力，因而机体内H₂O₂的含量也可以作为精子质膜过氧化损伤的检测指标。通过测定这些指标的变化，反映精子在稀释液环境中的生存情况。

精液的常温保存是一项在17℃条件下，通过添加稀释液来延长精子体外存活时间的技术。精子顶体蛋白酶在17℃能够达到最佳活性(Pinart 2013)。由于精子在17℃环境下能够进行正常的代谢活动，产生有害物质，因而稀释液中往往需要添加相应的抗氧化剂或其他药物，如青链霉素等，保持其微环境的相对稳定性。

发明内容

本发明以茶多酚(TPP)和壳聚糖(CS)作为抗氧化剂的主要成分，通过联合添加不同浓度的茶多酚和壳聚糖，以稀释后精子的活率、质膜完整率、精液中的MDA含量、CAT活性、SOD活性、GSH-Px活性及细菌含量为评定指标，筛选茶多酚和壳聚糖的最佳配伍浓度，以保证猪精液在常温保存过程中维持良好的生物活性。

本发明提供了茶多酚与壳聚糖配伍作为猪精液常温保存用稀释液的应用。

本发明还提供了一种猪精液常温保存用稀释液，该常温保存稀释液包含茶多酚与壳聚糖。

进一步，本发明的猪精液常温保存用稀释液组分为：每1L所述猪精液常温保存用稀释液的配方为：茶多酚0.02g，壳聚糖0.05g，葡萄糖38g，柠檬酸钠6.5g，EDTA 1.2g，碳酸氢钠1g，柠檬酸0.25g，氯化钾0.6g，β-环糊精0.9g，其余为超纯水。

本发明的猪精液常温保存的抗氧化剂，由于采用了茶多酚与壳聚糖配伍作为抗氧化剂，两者之间存在依赖性的协同关系，适当浓度的茶多酚与壳聚糖配伍能够在猪精液常温保存过程中很好地保护猪精子的生理活性。

附图说明

图1为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液SOD活性的影响；

图2为不同浓度的茶多酚-壳聚糖配伍对常温(17℃)保存猪精液CAT活性的影响；